秦皇岛市替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌体外抗菌活性研究

张晓玲 霍丽静 刘鹏 彭宗生

肺炎克雷伯菌是一种重要的医院内感染病原体，随着高产超广谱β内酰胺酶的菌株占致病菌的比例逐年增高，作为应对该类细菌致严重感染的碳青霉烯类抗生素的临床使用也不断增多，催生出更多的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株，给临床抗感染治疗带来极大的挑战。替加环素作为新一代超广谱抗生素，于2005年6月得到美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗成人复杂腹腔内感染和复杂的皮肤及软组织感染，是第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物。替加环素的作用机制主要是通过与核糖体30S亚基结合从而抑制蛋白质的合成［1］。体外药敏结果显示对甲氧西林耐药葡萄球菌、青霉素耐药肺炎链球菌、万古霉素耐药肠球菌及多数革兰阴性杆菌具良好的抗菌活性。是目前少数对耐碳青霉烯类菌株有抗菌活性的抗菌药物之一。随着替加环素在临床使用的增加，需要快速、准确的药敏结果指导临床合理使用该类抗菌药物。为了解其对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性，本研究回顾性收集秦皇岛地区三所大型医院2012年1月至2013年6月临床分离出的49株亚胺培南或美罗培南耐药的肺炎克雷伯菌，采用CLSI推荐的检测MIC的参考方法琼脂稀释法检测替加环素的MIC值，以了解秦皇岛地区替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性，为该药在临床上的使用提供体外药物检测依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集港口医院、秦皇岛市第三医院和秦皇岛市北戴河医院2012至2013年临床分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌共49株，1个患者只收集一次菌株，以保证菌株的不重复性。并记录患者的科室，病种，年龄等基本情况。按照CLSI 2011年M100-S21中折点判定标准厄它培南 MIC≥0.5 mg/L，美罗培南MIC≥2.0 mg/L或亚胺培南 MIC≥2.0 mg/L，判定为耐碳青酶烯类药物菌株。

1.2 抗菌药物及培养基 抗菌药物标准品:替加环素标准粉(美国辉瑞制药有限公司，批号:L28832-6)储存于≤20℃冰箱内，避免反复冻融。美罗培南(住友制药)，亚胺培南(杭州默沙东制药有限公司)，厄他培南(杭州默沙东制药有限公司)。试验培养基为Mueller-Hinton琼脂(美国Oxoid公司)。

1.3 方法 MIC值测定:药敏试验严格按照2009年《新型甘氨酰环素类抗菌药物替加环素的体外药敏试验操作规程》［2］及CLSI推荐的琼脂稀释法测定替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的MIC值。根据《替加环素体外药敏试验操作规程专家共识》［3］，隔夜存放的M-H琼脂会使检测结果升高。本研究使用的M-H琼脂均为当天新鲜配制。另外由于替加环素含多酚基团，理化性质活泼，易氧化降解或形成差向异构体，在光线及空气中久置会导致替加环素有效抗菌活性降低，影响检测结果。所以试验中配制M-H琼脂稀释的药物原液和稀释的过程要严格避光，尽量减少与空气解触的时间(黑布遮盖，加盖)。稀释好的不同浓度的含替加环素的M-H培养基加橡胶塞密封置于培养箱中24 h观察结果。为保证结果的准确性同时用琼脂稀释法做质控菌的MIC值，质控菌结果在CLSI规定范围内，才可统计结果。

1.4 质控范围和折点判定 目前CLSI没有替加环素的药敏结果判定标准，只给出了替加环素药敏试验中质控菌株可接受的质量控制范围。本研究中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌应用大肠埃希菌ATCC25922的质控范围0.03 ～0.25 mg/L。另外，由于 CLSI中尚无替加环素的MIC及折点判定标准，根据《替加环素体外药敏试验操作规程专家共识》，本研究中替加环素的折点采用FDA的折点判定标准:MIC≤2 mg/L为敏感，MIC≥8 mg/L为耐药，MIC=4 mg/L为中介。

1.5 统计学分析 应用WHONET 5.6软件，建立药敏结果数据库并进行药敏结果数据分析。

2 结果

2.1 49株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外药敏结果 49株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中，对替加环素敏感共45株占92.0%，中介共4株占8.0%，耐药共0株。可见替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌具备较高的体外抗菌活性。见表1。

表1 替加环素对49株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外药敏结果

2.2 49株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的体外敏感率分布。MIC为2 mg/L时，敏感率达92.0%，MIC 为 4 mg/L，敏感率达 100%。MIC50为1 mg/L，MIC90为2 mg/L，具有较好的体外敏感率。见表2。

表2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的体外敏感率分布 %

3 讨论

肺炎克雷伯菌是医院内和社区获得性感染的重要肠杆菌科细菌。碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染最重要的抗菌药物。近年来，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，一些地区革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药现象显著增加。其中，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌占相当比例。自2001年在美国发现由质粒介导的KPC-1型碳青霉烯酶以来，世界各地陆续检出了产碳青霉烯酶菌株。我国于2007年报道浙江省检出产KPC-2型酶肺炎克雷伯菌。近年，细菌耐药检测网统计中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的比例逐年增多，引起了普遍关注。已有研究表明［4］，碳青霉烯类抗生素耐药主要机制是菌株产生碳青霉烯类水解酶。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制复杂，可与碳青霉烯酶产生、质粒型AmpC酶的过度表达合并外膜孔蛋白的丢失、碳青霉烯类高亲和位点PBP2的数量下降、缺失或亲和力下降等机制有关。肺炎克雷伯菌产酶基因的多样性及其并存和表达，给临床治疗耐药菌感染带来了极大的挑战［4］。

替加环素作为一种半合成的四环素类药物，在米诺环素9位分子上添加叔丁基甘氨肽氨基团而衍生的一种新型四环素类抗生素。由于9位替代基团形成的空间位阻作用，使其与核糖体靶位的亲和性比米诺环素和四环素高5倍以上，且细菌对其不易产生耐药性［5］。替加环素不能激活四环素外排蛋白，因此微生物外排泵无法将甘氨酰四环素类药物排至胞外。正是由于它克服了获得性的核糖体保护tet(M)和主动外排tet(A-E)这两个临床上产生耐药性的机制，从而使细菌对替加环素产生显著耐药性的可能性很小，只有及其显著的突变才有可能导致细菌对替加环素的耐药。因而替加环素目前被认为是一种具有高效而广谱的抗菌活性的抗生素。

本研究检测2012至2013年秦皇岛三所大型医院203例肺炎克雷伯菌，其中49例为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌占24%。对菌株来源进行统计，其中来源于ICU的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌为19例占38.8%，来源于呼吸科的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌为21例占42.9%，另外肿瘤患者合并肺部感染3例、外伤手术后感染患2例、菌血症2例、腹膜炎1例、重度糖尿病1例。可见来源于ICU和呼吸科的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌占相当大比例，为81.6%。秦皇岛地区的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌流行趋势不容乐观，给临床选择用药带来了极大的困难。

本研究显示，替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌表现出良好的体外抗菌活性，对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外敏感率可达92.0%，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素未表现有耐药株。由于该药在临床用药方便及与其他药物无交叉耐药，且肝肾毒性低等特点，使其在临床抗感染治疗中具有非常乐观的前景，因此替加环素可首选用于临床耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌引起感染的治疗。同时，做好替加环素的体外药敏监测，为临床科学、合理、高效的使用此药提供支持，为医院感染控制提供确切的依据，是临床细菌工作者需要做的一项重要工作。

1 杜小幸，王海萍，傅鹰，等.不同药敏方法检测替加环素对鲍曼不动杆菌敏感性的比较.中华检验医学杂志，2013，36:598-599.

2 王辉，倪语星，陈民钧，等.新型甘氨酰环素类抗菌药物替加环素的体外药敏试验操作规程.中华检验医学杂志，2009，32:1208-1213.

3 王辉，俞云松，王明贵，等.替加环素体外药敏试验操作规程专家共识.中华检验医学杂志，2013，36:584-587.

4 杨丽君，陈坚，杨燕，等.碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌基因型检测和同源性分析.中华检验医学杂志，2013，36:318-323.