基于纳米材料增效的2，6-二叔丁基对甲酚分子印迹电化学传感器的研究及应用*

冷鹏，李亲凯，刘素

(1.山东城市建设职业学院，济南 250103； 2.济南大学资源与环境学院，济南 250022)

2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)是一种无臭无味但热稳定性良好的白色或浅黄色结晶体。BHT作为人工合成的抗氧化剂，属于油溶性抗氧化剂，目前在我国生产量很大［1］。人们常在食品中添加适量的BHT以延迟和阻止食品氧化变质，但过量接触和摄入容易对人体造成严重危害，如使人体呼吸酶的活性受到抑制，致癌等［2］。为防止和限制食品中BHT的添加使用量超标，GB／T 2760–1996明确规定了其使用量限值为0.2 g／kg［3］。目前，用于检测食品中BHT含量的方法很多，其中常用的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、光度法及在线分析技术等［4–9］。这些方法灵敏度高，但仪器昂贵、样品预处理复杂，且测试人员需经专业培训才能完成检测。生物传感检测是食品安全领域中的热门检测方法之一，生物体中的酶、抗体、组织等均具有特异性识别特定物质的能力，可以作为生物传感器的识别分子［10］。生物传感器的优点是专一程度高、检测速度快、操作相对简单。不足之处在于稳定性差、构建成本高且重复利用率低。分子印迹技术 (Molecular Imprinting Technology，MIT)就是把某一特定化学物质当作目标模板，制备对其特异性识别的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)的过程［11–12］。该识别类似于抗原与抗体、酶与底物及激素药物与受体等，具有高度的专一性和特异性。分子印迹聚合物具有结构可控性好、环境耐受性好且易于保存等特点，这种用聚合物作为识别元件构建得到的仿生传感器，足以克服上述生物传感器的诸多缺点［13］。笔者以BHT为检测目标，利用分子印迹技术和表面修饰技术构建了一种基于纳米材料增效的BHT分子印迹电化学传感器(以下简称分子印迹传感器)。

1 实验部分

1．1 主要仪器与试剂

电化学工作站：VersaSTAT3型，美国阿美特克公司；

磁力搅拌器：海门市麒麟医用仪器厂；

电子天平：EL204型，梅特勒–托利多仪器有限公司；

三电极系统：铂丝电极为对电极，Ag／AgCl电极为参比电极，修饰后的金电极为工作电极；

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；

石墨粉、高锰酸钾、浓硫酸、盐酸、氯金酸(HAuCl4溶液质量分数为1%)、乙醇、甲醇、BHT、冰乙酸、硼氢化钠(NaBH4)、邻氨基苯硫酚(o-ATP)：分析纯，阿拉丁有限公司(上海)；

磷酸缓冲液(PBS)：用磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)和NaCl配制；

植物油脂：市购；实验用水为超纯去离子水；实验所用其它试剂为分析纯。

1．2 传感器的制备

1.2.1 石墨烯的制备

将1 g石墨粉和0.5 g硝酸钠加入到50 mL浓硫酸中，搅拌，再分多次将6 g高锰酸钾加入到上述混合液中，于20℃水浴；搅拌1 h后，于35℃水浴30 min，加入100 mL去离子水，持续搅拌20 min；加入适量的双氧水，得溶液变成亮黄色后，趁热过滤，用盐酸洗涤，直至滤液中无硫酸根被检出。将获得固体置于真空干燥箱中，于60℃干燥2 h；称取干燥物100 mg，于100 mL蒸馏水中超声振荡1 h后真空干燥，即得氧化石墨烯粉末。

称取0.06 g氧化石墨烯置于盛有60 mL水的烧杯中，超声分散8 h，加入1.5 mL PSS和0.5 mL水合肼，于90℃搅拌24 h，得到黑色分散液，用水冲洗多次，将所得物质超声分散到15 mL水中，得到石墨烯溶液［14］。

1.2.2 邻氨基苯硫酚功能化纳米金(F-AuNPs)的制备

将32 mg氯金酸加入到10 mL乙醇中，将6 mg邻氨基苯硫酚(o-ATP)加入到5 mL甲醇中，将二者混合，进行冰浴(0℃)并搅拌1 h，期间加入0.4 mL冰乙酸，得到黑褐色悬浮液。然后往该悬浮液中逐滴加入2.5 mL 0.5 mol／L NaBH4溶液，并继续在冰浴环境中搅拌1 h，将得到的褐色溶液在室温下静置10 h。去除上清液，将剩余沉淀部分混匀，分批装入离心管内，以1×104r／min离心10 min。将离心后所得到的沉淀依次用水洗涤多次，并分别用甲醇和乙醇溶液各洗涤2次。

1.2.3 分子印迹聚合物溶液的制备

取适量pH 6.5的PBS溶液，向溶液中加入适量BHT和F-AuNPs，溶液的浓度为5×10–3mol／L，于黑暗环境中静置5 h以上，以此完成预组装过程，即得到分子印迹聚合物溶液。

1.2.4 分子印迹传感器界面的构建

分子印迹传感器的构建如图1所示。用移液枪吸取10 μL石墨烯均一溶液滴加到已处理好的金电极表面，室温下过夜干燥；采用电聚合的方式将分子印迹聚合物沉积到石墨烯修饰电极表面［15–16］，电化学工作站扫描电压为0.35～0.85 V，扫描速率为50 mV／s，扫描20圈。聚合物干燥后，采用0.1 mol／L的盐酸溶液将模板分子BHT洗脱，即得到分子印迹电化学传感器。

按照相同的构建程序组建非分子印迹传感器，构建过程中的电聚合使用的聚合物不包含模板分子BHT。

图1 分子印迹传感器的构建原理

1．3 样品预处理

以花生油作为检测样品，预处理程序：2.0 g样品与5 mL乙醇充分融合12 h；分别取1.0 mL悬浮液以PBS溶液稀释，备用。

1．4 电化学测量

修饰电极的表征在含有5 mmol／L K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L KCl水溶液中通过循环伏安法完成，扫描速率为50 mV／s，电压范围为–0.2～0.6 V。其它实验通过差分脉冲伏安法完成，将修饰好的电极分别放入5 mmol／L的K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L的KCl水溶液中，电压范围为–0.2～0.6 V，扫描速率为5 mV／s。

2 结果与讨论

2．1 电极修饰过程的循环伏安表征

通过循环伏安法对传感器的构建过程进行表征，电极修饰过程的循环伏安曲线见图2。a为裸电极循环伏安曲线；b为石墨烯修饰金电极的循环伏安曲线，由于石墨烯可以促进电子传输，该氧化还原峰电流响应相比于裸电极电流响应有明显的增加；c为电聚合分子印迹聚合物后的循环伏安曲线，与曲线b相比，电信号有了显著下降，这是因为分子印迹聚合膜阻断了电极表面的电子传递：d为洗脱模板分子以后的循环伏安曲线，电信号有一定的增强，这是由于模板分子被洗脱掉之后，电极表面形成很多孔穴，这些孔穴增加了电子传递的有效表面积，促进了电子传递，进而提高了电极的电流响应。

a—裸金电极； b—石墨烯／金电极； c—MIPs／石墨烯／金电极；d—洗脱之后的MIPs／石墨烯／金电极图2 电极修饰过程的循环伏安曲线

2．2 扫描圈数对分子印迹传感器电流响应的影响

不同的扫描圈数会对电聚合膜厚度产生影响，而不同厚度的电聚合膜的分子印迹传感器的稳定性和灵敏度不同，采用循环伏安法对不同电聚合扫描圈数(5，10，15，20，25)的传感器电流响应进行优化，结果见图3。由图3可见，当扫描圈数从5增加到20时，传感器的电流响应随之增大并达到最大值。这是因为当电聚合圈数少于20圈时，电聚合膜会因为太薄而容易破裂，因此传感器的电流响应相对较小；当扫描圈数大于20时，电聚合膜会因为太厚而使得模板分子不容易被洗脱，故所测得的传感器电流响应有所下降。综上考虑，选择最佳扫描圈数为20圈。

图3 电聚合扫描圈数对传感器电流的影响

2．3 模板分子和功能单体摩尔比的优化

由不同模板分子和功能单体的摩尔比构建得到的传感器其性能有很大不同，因此需要对不同模板分子和功能单体的摩尔比进行优化试验，结果见图4。由图4可知，当模板分子与功能单体的摩尔比高于1∶1时，电流响应相对较小，这是因为若功能单体的数量过少，可能导致其不能与模板分子进行充分结合；当模板分子与功能单体的摩尔比低于1∶1时，电流响应同样不断下降，这可能是因为模板分子的数量太少而使功能单体过多地占据电极表面，从而导致结合位点过少，使电流响应不断下降。当模板分子与功能单体的摩尔比为1∶1时，传感器的电流响应达到最大。

图4 模板分子与功能单体的摩尔比对传感器电流响应的影响

2．4 洗脱时间的优化

传感器的识别能力与洗脱时间的长短密切相关，洗脱时间过长整个电聚合膜容易被洗脱掉；太短则模板分子不能被洗脱。因此用0.1 mol／L的盐酸溶液分别对传感器冲洗 5，10，15，20，25 min，并对传感器的电流响应进行检测，结果见图5。

图5 不同洗脱时间对传感器电流响应的影响

由图5可知，当洗脱时间低于10 min时，传感器的电流响应逐渐增大并达到最大，很明显模板分子被洗脱之后电极表面不断形成很多孔穴，这些孔穴增加了电子传递的有效表面积，促进了电子传递，进而提高了电极的电流响应；当洗脱时间大于10 min时，电极表面修饰的聚合物与石墨烯会被洗脱掉，不能促进电子传输，故电流响应不断减小。因此选择洗脱时间为10 min。

2．5 分子印迹传感器孵化时间优化

将构建的分子印迹传感器在5×10–3mol／L的BHT 溶液中分别浸泡 5，10，15，20，25 min，再对传感器的响应电流进行检测，结果见图6。由图6可知，孵化时间由5 min增大到20 min时电流响应不断增加，这是因为在此孵化时间段内，模板分子在传感器上的结合效果随时间的延长而变得更好；当孵化时间超过20 min，传感器表面的修饰物石墨烯和聚合物会脱落，故电流响应又会下降。因此最优孵化时间为20 min。

图6 不同孵化时间对传感器电流响应的影响

2．6 分子印迹传感器的标准曲线

为了研究构建得到的分子印迹传感器的分析性能，利用DPV法对其线性检测范围和最低检测限(LOD)进行测定。首先构建分子印迹和非分子印迹两类电传感器，然后将其在含有BHT的PBS缓冲液中浸泡20 min，进行DPV检测，检测结果见图7。

a—分子印迹传感器； b—非分子印迹传感器图7 传感器的标准曲线

由图7可知，分子印迹传感器的检测范围为5×10–6～1×10–2mol／L，最低检测限为 1.56×10–6mol／L。非分子印迹传感器的电流响应和电流变化很小，不具备特异性识别BHT的能力。

2．7 分子印迹传感器的特异性分析

选取几种与BHT结构相似的物质作为干扰物，包括叔丁基氢醌(TBHQ)、叔丁基羟基茴香醚(BHA)和没食子酸丙酯(PG)，以此来验证所构建得到的分子印迹传感器对模板分子的专一选择的特性。其电流响应见图8。由图8可见，分子印迹传感器的电流响应比非分子印迹传感器的电流响应大，而且分子印迹电化学传感器对BHT的选择性好。

a—5×10–3 mol／L BHT 溶液； b—5×10–3 mol／L TBHQ ；c—5 ×10–3 mol／LBHA 溶液；d—5×10–3 mol／LPG 溶液图8 分子印迹和非分子印迹传感器对BHT选择性识别

2．8 分子印迹传感器的再现性、重复性和稳定性

最优条件下组建5支传感器，每支电极只检测一次浓度为 5×10–3mol／L 的 BHT 溶液，电流响应测 定 结 果 为 244.22，243.87，242.90，243.29，243.57 μA，相对标准偏差为4.6%，表明传感器具有良好的再现性。在相同条件下组建5支分子印迹电化学传感器，每支传感器检测5×10–3mol／L BHT溶液电流响应测定结果为 243.51，243.57，243.63 μA，相对标准偏差为4.8%。结果说明构建的传感器可以实现对BHT的重复性检测。制备3支传感器，于室温下保存2周，检测传感器的电流响应，得到的电流