养阴活胃合剂对慢性萎缩性胃炎模型大鼠胃黏膜淋巴细胞瘤-2基因和三叶因子1表达的影响

陈彦竹 何小艳 曾斌芳

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)为胃癌前变化的最初阶段，国内临床报道中药可以阻断或逆转胃癌的癌前病变［1］。CAG病因复杂，具有病程长、反复发作的特点。经过多年临床验证总结出养阴活胃合剂方，可改善CAG患者临床症状，能够改善局部病理以及逆转胃黏膜的病理状态，使病变胃黏膜趋于正常，对治疗慢性萎缩性胃炎有良好效果［2］，为了探讨该方对CAG的作用机制，本研究团队应用该方对动物模型进行了研究，观察其对CAG大鼠胃黏膜细胞相关因子B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和三叶因子 1(trefoil factor 1，TFF1)基因表达的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物

清洁级成年雄性Wistar大鼠96只，体质量150～200 g，标准颗粒饲料，均由新疆医科大学实验动物中心提供［许可证号:SCXK(新)2003-0001］。

1．2 药物及给药方法

中药养阴活胃合剂组成:阿魏、芦根、白术、茯苓、鸡内金、莪术各15 g、海螵蛸30 g、旋覆花10 g、炙远志、砂仁、炙甘草各6 g。由新疆维吾尔自治区中医药研究院提供水煎剂。模型复制成功后除空白对照组常规饲养、自由进食水外，模型组继续施加上述造模因素，养阴活胃合剂高、中、低剂量组分别喂饲水煎剂2．22 g/(kg·d)、1．48 g/(kg·d)和 0．74 g/(kg·d)，阳性药物对照组予维酶素0．86 g/(kg·d)灌胃，共12周。

1．3 主要试剂与仪器

(今宁)维酶素片(湖北绿金子药业有限责任公司生产，批号:120901);无水乙醇(天津市静海县大邱庄工业园区生产，批号:20131106);水杨酸钠(天津市化学试剂三厂生产，批号:20070916);兔抗Bcl-2多抗IgG，免疫组化试剂盒为英国abcam公司产品;兔抗TFF1多抗IgG，免疫组化试剂盒为美国GeneTex公司产品。

TD5AWS台式离心机(长沙湘仪离心仪器有限公司);电热恒温培养箱DNP-9162(上海跃进医用光学仪器厂)。

1．4 模型制备

将实验大鼠随机分为6组，即空白对照组，模型组，阳性药物对照组，中药高、中、低剂量组，每组16只。大鼠颗粒饲料适应性喂养1周后，空白对照组常规饲养、自由进食水，其余5组将2 g水杨酸钠加入100 mL的30%乙醇溶液中，给大鼠灌胃3 mL/d，灌胃前1小时禁食、禁水;再配合隔日进食不禁水法，直到12周造模结束。每组处死2只大鼠，观察胃黏膜肠上皮化生和萎缩情况，以证实CAG造模成功。

1．5 取材及标本处理

末次给药后禁食不禁水24小时，5%戊巴比妥麻醉大鼠，剖取全胃，沿胃大弯侧剖胃腔，作大体观察，以4%多聚甲醛溶液固定，常规取材，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下组织形态观察。

1．6 Bcl-2与TFF1免疫组化染色方法

采用通用型二步法免疫组化法检测。石蜡切片脱蜡至水洗;3%H2O2去除内源性过氧化氢酶，PBS液冲洗3次，蒸馏水洗3次;枸橼酸钠缓冲液修复抗原，PBS冲洗3次，蒸馏水洗3次;加入山羊血清封闭非特异性抗原;一抗按照适当比例稀释滴入(以PBS代替一抗作为阴性对照)，4℃冰箱孵育过夜，次日37℃下复温30分钟，PBS冲洗3次;滴加通用型二抗，37℃温箱孵育25分钟，PBS洗涤3次;DAB显色3～5分钟，苏木素复染10秒，蒸馏水冲洗返蓝;各级乙醇脱水;二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。各指标结果用标记指数(u)表示:LI:阳性细胞数/计数细胞总数×100%。在高倍镜下选取5个有代表性的视野，每个视野记数100个细胞，计算各指标阳性细胞表达率。

1．7 统计学处理

应用SPSS 17．0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差±s)表示，采用单因素方差分析进行统计分析，经检验数据服从正态分布且方差齐，组间比较采用LSD法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大鼠胃组织肉眼观察比较

空白对照组大鼠胃黏膜柔软，表面较多黏液，皱襞面光滑，胃壁弹性良好，呈橘红色。模型组大鼠胃黏膜薄弱粗糙，灰白色泽，表面黏液减少，可见细小颗粒和结节，亦可见黏膜糜烂出血，皱襞变细，胃壁弹性减低，养阴活胃合剂组及阳性药维酶素组部分胃黏膜基本恢复正常，以养阴活胃合剂组为明显。

2．2 胃组织形态观察比较

空白对照组大鼠胃黏膜厚度正常，黏膜上皮层呈单层柱状，上皮细胞及腺体排列整齐，大小形状较为一致，固有层可见少许嗜酸性粒细胞散在，无增生和化生现象，肌层未见明显变化。模型组胃黏膜固有层腺体均有不同程度减少，胃黏膜固有层变薄，黏膜下层充血、水肿，黏膜固有层下部局灶性淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润较明显，可见黏膜肌层增厚，胃幽门部位腺体结构不完整，肠上皮化生。阳性药物对照组胃黏膜较薄，固有层腺体有轻度减少，淋巴细胞灶性浸润。中药高剂量组胃黏膜基本正常，腺体排列较规整，可见散在淋巴细胞灶性浸润，未见肠上皮化生。见图1。说明养阴活胃合剂与阳性药物对照组均能改善胃黏膜的病理形态，但以养阴活胃合剂效果为佳。

2．3 各组大鼠胃黏膜Bcl-2免疫组化染色统计的比较

Bcl-2蛋白阳性反应物质呈棕黄色颗粒，主要位于细胞浆内。空白对照组大鼠胃黏膜有极少量阳性细胞染色为细胞质染色，细胞核有少量表达;阳性药物对照组和中药高、中剂量组大鼠胃黏膜部分细胞可见黄色、褐色程度不同的染色，与模型组比较染色较浅;模型组染色最重。见图2。

图1 大鼠胃黏膜组织HE染色病理切片(HE×200)

图2 各组大鼠胃黏膜中Bcl-2蛋白的表达情况(×200)

采用阳性着色细胞计数法，统计结果:与空白对照组比较，各组Bcl-2蛋白阳性表达率均明显升高(P＜0．05);与模型组比较，中药高、中剂量组和阳性药物对照组Bcl-2蛋白阳性表达率均明显降低(P＜0．05);与阳性药物对照组比较，中药高剂量组Bcl-2蛋白阳性表达率明显降低，差异有统计学意义(P＜0．05);中药高、中、低剂量组间比较，中药低剂量组Bcl-2明显高于中药高、中剂量组(P＜0．05)。见表1。

2．4 各组大鼠胃黏膜TFF1免疫组化染色统计的比较

TFF1主要表达于胃黏膜腺体细胞胞浆中，细胞膜及细胞核中有少量表达。空白对照组大鼠胃黏膜腺体细胞胞浆有大量阳性细胞表达，核周聚焦明显，呈棕黄色，染色最深见于接近腔面的细胞;阳性药物对照组和中药组大鼠胃黏膜部分细胞可见黄色程度不等的染色，与模型组比较染色较重;模型组染色最轻。见图3。

表1 各组大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1阳性表达率的比较±s，表达率/%)

表1 各组大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1阳性表达率的比较±s，表达率/%)

注:与模型组比较，a P＜0．05;与空白对照组比较，b P＜0．05;与阳性药物对照组比较，c P＜0．05;与中药低剂量组比较，d P＜0．05。

14 18．08 ±1．62 95．66 ±1．7阳性药物对照组 13 37．45 ±2．69ab 89．40 ±2．45ab模型组 11 43．41 ±3．14b 84．00 ±2．79b中药高剂量组 12 32．25 ±2．59abcd 93．33 ±4．18acd中药中剂量组 12 34．90 ±3．28abd 90．90 ±5．76abd中药低剂量组 13 40．54 ±7．03b 86．68 ±5．01阳性空白对照组组别 n Bcl-2阳性 TFF1 b

图3 各组大鼠胃黏膜中TFF1蛋白的表达情况(×200)

采用阳性着色细胞计数法，统计结果:与空白对照组比较，除中药高剂量组接近于空白对照组外(P＞0．05)，其余各组TFF1阳性表达率均明显降低(P＜0．05);与模型组比较，中药高、中剂量组和阳性药物对照组TFF1蛋白阳性表达率均明显升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与阳性药物对照组比较，中药高剂量组TFF1蛋白阳性表达率明显升高(P＜0．05);中药高、中、低剂量组间比较，中药低剂量组TFF1阳性表达率明显低于中药高、中剂量组(P ＜0．05)。见表1。

3 讨论

CAG多由慢性浅表性胃炎演变而成，是导致胃癌发生的重要原因。其病情迁延反复难愈，兼于长期的病理损伤本身、内伤外邪等诸多因素而导致血络瘀阻。本实验中养阴活胃合剂能够改善大鼠腺体萎缩情况，使病变胃黏膜趋于正常，对CAG大鼠有良好治疗作用。方中芦根养阴和胃降逆，配伍白术、茯苓健脾助运，加之阿魏消积散痞，莪术可活血行气止痛，旋复花、炙远志兼顾疏肝理气、化痰通络，合鸡内金、砂仁消食和胃，诸药配合，标本兼顾，共奏养阴活血，化痰和胃之功。

临床资料证实胃癌前状态和胃癌组织中TFF1的表达明显下调，可能是胃黏膜恶变的早期事件之一［3］。TFF1作为三叶因子家族成员之一，具有保护胃肠道黏膜、促进细胞迁移和黏膜修复的重要作用。本研究结果发现，中药组TFF1阳性表达率明显高于其他各组，提示养阴活胃合剂可能通过增加胃黏膜TFF1表达而起到治疗慢性萎缩性胃炎的作用，从而抑制肿瘤的产生。Bcl-2是Tsujimoro等人在1985年最先从滤泡性非霍奇金淋巴瘤中分离出来的一个抗凋亡基因。转基因研究表明，Bcl-2为致癌基因，主要通过抑制线粒体依赖性凋亡通路被激活的功能达到抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的作用造成肿瘤细胞堆积［4］。本研究发现模型组大鼠胃窦黏膜Bcl-2阳性表达明显升高，经养阴活胃合剂干预后，中药高、中剂量组及阳性药物对照组Bcl-2蛋白阳性表达均呈减少趋势，表明养阴活胃合剂能不同程度地下调Bcl-2蛋白表达，可能在一定程度上促使胃黏膜上皮细胞细胞增殖和细胞凋亡平衡，改善甚至逆转CAG胃黏膜的病理状态。

综上所述，通过本研究提示养阴活胃合剂可明显降低Bcl-2和增强TFF1的表达，通过保护胃黏膜细胞，阻止癌前病变进一步发展，促使病变胃黏膜恢复正常，起到改善甚至逆转CAG病变的作用。

［1］ 王文，张仲海，夏天．消萎灵对大鼠胃黏膜癌前病变的逆转作用［J］．新中医，1999，31(7):39-40．

［2］ 戴明，丁国宁，雷云霞，等．养阴活胃合剂治疗慢性萎缩性胃炎患者胃镜组织学影响［J］．陕西中医，2013，7(9):34．

［3］ 石淑青，蔡建庭．三叶因子Ⅰ和Ⅱ在胃癌和癌前状态中的表达［J］．中华内科杂志，2004，43(3):195-198．

［4］ Mariano M T，Moritti I，Donelli A，et al．Bcl-2 gene expression in hemato poietic cell differentiation［J］．Blood，1997，80:768-775．