p53 抑癌基因电化学阻抗传感器研究*

杜芳静，胡晓琴，宋 珂，李晓霞

(延安大学 化学与化工学院，陕西 延安716000)

0 引 言

电化学DNA 传感器(elctrochemical DNA sensor)是将探针DNA 固定在电极表面上，通过检测电化学信号进行分析的器件。此类传感器具有简单、灵敏、快速、低成本及低能耗等特点，在疾病诊断、环境检测和食品安全等领域有着重要的应用价值和广阔的应用前景［1～3］。p53 抑癌基因(p53－DNA)是生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因，可诱导细胞生长阻滞，细胞凋亡，细胞分化以及DNA 修复［4］。目前已报道p53－DNA 的分析方法有电化学法［5～7］、光学法［8］和免疫法［9］。电化学阻抗(elctrochemical impedance spectroscopy，EIS)技术是利用小幅度交流电压或电流对电极扰动，测量体系对扰动跟随情况的电化学响应的测量方法，该方法具有频率范围广、对体系扰动小等特点，是研究电极过程动力学、电极表面现象等的重要工具［10，11］。

本文基于电化学阻抗技术构建了一种检测p53－DNA的电化学传感器，将末端带巯基的探针p53－DNA 固定于金电极表面，根据传感器结合前后电子转移阻抗值的变化，对目标p53－DNA 进行了分析与测定。该传感器制备简单、灵敏高，且无需标记，易于操作，可用于不同序列DNA 的研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华);Q5200B超声仪(江苏昆山);HG—9140A 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏设备);电极系统:Au 为工作电极，Ag/AgCl 电极为参比电极，Pt 为对电极。

铁氰化钾和亚铁氰化钾(西安化学试剂厂);单链DNA(上海生工)序列参见文献［5］;单链DNA 储备液:用pH 7.0，10 mmol/L PBS 缓冲溶液配制;5.0 mmol/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6;检测液:用pH 7.4，0.10 mol/L PBS－0.10 mol/L NaCl 配制;实验用水均为Millipore Milli—Q 超纯水(大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

首先将Au 进行预处理［12］。将5 μL 5.0 μmol/L 探针p53－DNA 溶液滴涂在处理好的Au 表面，4 ℃固定12 h，然后用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超纯水冲洗，以除去吸附的探针;用5.0 μL，1.0 mmol/L MCH 封闭1 h，得到p53－DNA传感器，4 ℃冰箱中保存待用。将5.0 μL 不同浓度目标p53－DNA 滴加到p53－DNA 传感器上，37 ℃杂交反应1 h。在5.0 mmol/L/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6］检测液中进行测定，根据传感器杂交前后电子转移阻抗值的变化分析信号，对目标p53－DNA 进行定量检测。

2 结果与讨论

2.1 传感器的电化学表征

图1 为不同修饰电极在检测液中的循环伏安图。曲线a 为裸 Au 电极上的循环伏安曲线，结果发现，［Fe(CN)6］3－/4平衡电对的电位差为80 mV。探针p53－DNA 自组装到Au 电极表面后，由于DNA 的磷酸骨架带负电荷，阻碍荷负电的［Fe(CN)6］3－/4－的电子传递，峰电位差ΔE 明显增大且峰电流降低(曲线b)。当封闭剂MCH 占据了电极表面未结合的位点(曲线c)，峰电位差继续增大且峰电流也继续降低。探针DNA 与目标DNA 杂交之后形成双链DNA 结构(曲线d)，峰电位差达到最大，峰电流降到最低。以上结果表明:探针DNA 通过巯基自组装作用固定在电极表面，构建的p53－DNA 传感器与目标p53－DNA 发生了杂交反应。

图2 为不同电极的电化学阻抗图。可以看出，曲线a为裸金电极的阻抗，半圆较小，其电子传递阻抗Ret值为73.2 Ω。当探针DNA 固定到电极表面后，［Fe(CN)6］3－/4－电子传递受阻，电子传递阻抗Ret值增大到3 846 Ω。MCH封闭后，电子传递阻抗Ret值继续增大，说明MCH 在电极表面上形成致密的自组装膜，使得［Fe(CN)6］3－/4－电子传递变得更加困难。当杂交反应形成DNA 双螺旋结构，进一步阻碍了［Fe(CN)6］3－/4在电极表面的电子传递，因此，其电子传递阻抗Ret值达到9 271 Ω。阻抗法与循环伏安法表征的结果一致，说明DNA 传感器制备成功，并可以用于目标p53－DNA 的检测。

图1 不同电极在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的循环伏安图(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)Fig 1 Cyclic voltammograms of different electrodes in 5.0 mmol/L M［Fe(CN)6］3-/4-solution(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)

图2 不同电极在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的阻抗图Fig 2 Impedance diagram of different electrodes in 5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-solution

2.2 实验条件的选择

为了获得更高的灵敏度，首先考察了各种电化学参数对传感器的影响。首先研究了不同的电化学技术对灵敏度的影响，将制备好的传感器放入5×10－7mol/L，1×10－6mol/L两种不同浓度目标p53－DNA 溶液中，分别采用电化学阻抗法、微分脉冲伏安法和方波伏安法进行测定，实验结果说明使用电化学阻抗法测定灵敏度更高。因此，选用电化学阻抗法对目标p53－DNA 进行测定。图3 为探针DNA 不同固定时间与传感器杂交前后电化学阻抗变化值的关系曲线，可以看出，随着固定时间从8 h 增加到12 h，电子传递电阻值Ret逐渐增大，12 h 之后Ret值呈缓慢降低，说明探针固定12 h 趋于饱和。因此，实验选择探针固定时间为12 h。

图3 探针固定时间对传感器响应信号的影响Fig 3 Effect of immobilization time of probe on response signal of sensor

考察了杂交温度和杂交时间对传感器测定的影响，结果表明:杂交温度达到37 ℃时，电化学阻抗响应信号是最大的(图4(a))，37 ℃之后呈下降的趋势，说明在较高温度时，DNA 变性导致DNA 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构，不利于杂交［13］，所以，选择37 ℃为最佳杂交温度。图4(b)显示了当杂交时间达到1 h 时，Ret值最大，继续增加杂交时间，其Ret值变化较小，因此，选择DNA 杂交时间为1 h。

图4 杂交温度和杂交时间对响应信号的影响Fig 4 Effect of hybridization temperature and time on response signal

2.3 分析性能

在上述优化的实验条件下，利用制备好的传感器对一系列不同浓度的目标p53－DNA 进行定量测定。图5 为传感器在不同浓度目标p53－DNA 溶液中的电化学阻抗图。电子传递电阻Ret与目标p53－DNA 浓度在1×10－8～1×10－6mol/L 范围内呈线性关系(见附图)，线性回归方程为Ret(Ω)=37.74+4.666 7 C(C(mol/L))，相关系数为0.995 5，其检出限为3.0×10－9mol/L(S/N=3)。对5.0×10－8mol/L的目标p53－DNA 做11 次平行测定，相对标准偏差为3.8%。比较发现，本文方法测定线性范围较文献［7］宽，测定方法较文献［5］更简单。

2.4 选择性

利用制备好的DNA 传感器对完全互补p53－DNA、单碱基错配序列p53－DNA 和三碱基错配序列p53－DNA 进行测定。结果表明:传感器识别互补p53－DNA，其响应信号电子传递电阻Ret值为9 989 Ω，与单碱基错配p53－DNA 反应后，Ret值为4 495 Ω，与三碱基错配p53－DNA 反应后，Ret值为2 297 Ω，分别为完全互补的DNA 杂交信号的45%和23%。说明该传感器能够区分完全互补序列、单碱基错配序列和三碱基错配序列DNA，具有良好的选择性。

3 结 论

图5 传感器检测不同浓度目标DNA 的电化学阻抗图(插图为电子传递电阻Ret vs 目标p53-DNA 浓度)Fig 5 Electrochemical impedance diagram of biosensor detect different target DNA concentrations(Insert:Plots of the difference of electron transfer resistance(Ret)vs logarithmic of target p53-DNA concentration)

本文基于电化学阻抗技术构建了一种检测p53－DNA的电化学传感器，该传感器可以检测完全互补DNA 的范围是1.0×10－8～1.0×10－6mol/L，具有操作简单、无需标记、灵敏度高的优点，可以用于其它DNA 序列的检测。

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