模拟失重对雌性大鼠背根神经节的影响

任宁涛,张 恒,李 洁,雷 伟,张 然,张永刚,崔 赓

论 著

模拟失重对雌性大鼠背根神经节的影响

任宁涛1,张 恒1,李 洁2,雷 伟4,张 然3,张永刚1,崔 赓1

目的 观察模拟失重对雌性大鼠背根神经节(dorsal rootganglion, DRG)的影响。方法 选取健康雌性大鼠80只，随机分为尾部悬吊实验组(n=40)和正常对照组(n=40)。实验组按照Morey-Holton教授提出的方法保持-30°头低位及后肢自由悬垂不负重的状态，各组大鼠按标准条件进行饲养。4周后取右侧L5DRG，HE染色观测DRG细胞形态，免疫组化观测髓鞘情况，电镜观测DRG髓鞘及线粒体超微结构。结果 HE染色结果显示，与对照组相比，实验组DRG细胞间隙轻度增宽，部分节细胞与卫星细胞分离。免疫组化结果显示，对照组免疫组化染色及IOD值(0.573±0.007)较实验组IOD值(0.802±0.009)降低(P<0.05)，电镜下可见实验组髓鞘结构紊乱、松散，线粒体肿大、变形。结论 模拟失重可引起雌性大鼠DRG髓鞘及线粒体发生损伤性变化，推测模拟失重下可导致雌性大鼠DRG损伤。

模拟失重；背根神经节；动物模型

随着天空科技的不断进步，人类向宇宙探索的步伐愈来愈快，当宇航员离开地球重力环境暴露于失重环境下时可引起机体生理功能发生变化[1-3]，如骨质疏松[4，5]、肌肉萎缩[6]、心血管功能紊乱[7，8]等。背根神经节(dorsal rootganglion, DRG)作为感觉传入第一级神经元，作为功能性脊柱单位的“大脑”[9]，与腰背痛和根性痛有着密切的关系,失重状态下可引起DRG大神经元发生改变[10]。Morey-Holton和Globus[11]提出的大鼠尾部悬吊模型能够有效模拟失重状态，通过此模型发现模拟失重下可引起雌性大鼠L5DRG动作电位传导速度下降，髓鞘呈退变性改变[12]，但此研究未深入研究髓鞘形态改变，有其局限性。随着女航天员人数的日益增多，针对女性或雌性方面研究的重要性显得愈来愈凸显。为此，笔者研究模拟失重对雌性大鼠DRG影响，完善此类研究，为模拟失重下雌性大鼠DRG损伤提供更多的实验证据。

1 材料与方法

1.1 制备大鼠模拟失重模型 选用健康雌性SD大鼠80只，鼠龄为12～14周(体重约300 g)，随机分为实验组(n=40)和对照组(n=40)，实验组按照Morey- Holton[20]教授提出的方法保持-30°头低位及后肢自由悬垂不负重的状态，各组大鼠按标准条件进行饲养。

1.2 取材 4周后，每组大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)进行麻醉，麻醉后，进行DRG的摘取，两组各取右侧L5DRG 20个，制作冷冻切片，厚度为5 μm，用于DRG HE染色和免疫组化染色。相同的方法摘取右侧L5DRG 40个，两组各20个，用于电镜观测。

1.3 观测指标

1.3.1 HE染色 取DRG冷冻切片20个，两组各10个，切片固定→水洗→染苏木素→分化→于碱水中返蓝→伊红染色→脱水，透明，封片，镜下观察结果。

1.3.2 免疫组化检测 取DRG冷冻切片，室温放置30 min后，入4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗。用3%过氧化氢孵育5～10 min。5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。滴加一抗：单抗的Degen MBP (1∶1000; Chemicon Inc.)，37 ℃孵育2 h。滴加二抗：FITC标记的驴抗兔IgG，(1∶200；J ackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA)，37 ℃孵育30 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育30 min。封片后显微镜(奥林巴斯CX31)下观测，测定比较两组IOD值。

1.3.3 电镜观察 取DRG 40个，两组各20个，经 2%戊二醛和1%饿酸4 ℃固定，乙醇逐级脱水，Epon 812包埋液常规浸透、包埋,半薄切片,经甲苯胺蓝染色,光镜下定位,超薄切片(70 nm),再经铀-铅盐双染色，电镜(Hitachi，S-3400N)下观测实验组(尾部悬吊组)和对照组的髓鞘形态板层排列及DRG内线粒体形态。

2 结 果

2.1 两组大鼠基本情况 实验组大鼠饮食及活动均正常，体重增加与对照组差异不明显，无脱毛等现象。

2.2 DRG HE染色结果 与对照组相比，实验组

DRG细胞间隙轻度增宽，部分节细胞与卫星细胞分离(图1)。

2.3 DRG免疫组化结果 实验组Degen MBP表达较对照组增多(图2)，实验组免疫组化IOD值为0.802±0.009，对照组免疫组化IOD值为0.573±0.007，两组IOD值对比，对照组较实验组降低(P<0.05)。

2.4 DRG电镜观测结果 与对照组髓鞘致密板层结构相比，实验组髓鞘结构变得紊乱、松散(图3)，实验组髓鞘超微结构示髓鞘水肿、变性、部分脱落(图4)。线粒体电镜下观测示，实验组线粒体肿大、变形(图5)。

图1 大鼠背根神经节(HE，×100)

图2 大鼠背根神经节Degen MBP表达的

图3 电镜下大鼠背根神经节髓鞘结构(×5000)

图4 电镜下大鼠背根神经节髓鞘超微结构 (×50 000)

图5 电镜下大鼠背根神经节线粒体超微结构(×50 000)

3 讨 论

由于空间搭载进行实验研究的机会相对较少，而且成本很高，因此地面模拟失重研究成为对空间生命科学研究的重要补充。Morey-Holton等[11]提出的大鼠尾部悬吊模型已被广泛采用，可有效模拟失重状态。DRG作为功能性脊柱单位的“大脑”[9]，与腰背痛和根性痛有着密切的关系,其研究意义不言而明。与此同时，随着人类对外太空探索的需要，女航天员的人数越来越多，对雌性大鼠研究就越显尤为重要。前期的实验结果显示，尾部悬吊4周后即可出现明显的变化[5,7]，故本实验直接通过悬吊4周来观测模拟失重对雌性大鼠DRG的影响。本研究HE染色结果显示，通过4周的模拟失重，实验组DRG内出现细胞间隙轻度增宽，部分节细胞与卫星细胞分离，与其他研究失重下DRG变化结果相一致，证明此次造模成功，为后面的实验结果奠定理论基础，亦验证了前期实验的结果。

髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP) 位于髓鞘浆膜面, 是组成髓鞘的主要蛋白之一, 是神经系统所特有的蛋白质，具有神经组织特异性。Degen MBP是指退变的MBP，通过检测Degen MBP表达量可反映髓鞘的退变情况。本实验免疫组化结果显示，实验组Degen MBP表达较对照组增多，两组IOD值比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，由此可见模拟失重状态下可加速髓鞘的退变。电镜下亦可见实验组DRG髓鞘结构紊乱、扭曲，呈退变性改变，此结果更加直观的显示出模拟失重引起的髓鞘改变，与免疫组化结果相一致，从另一个角度验证了失重环境对雌性大鼠DRG的影响。

线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，因此有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。本研究4周的尾部悬吊发现，实验组线粒体肿胀明显、变形，呈损伤性变化，当线粒体发生损伤时，那么DRG的能量供应和细胞传递等过程都将受损。可间接引起DRG的损伤，此实验结果从能量供应方面验证了失重环境对雌性大鼠DRG的损害，为后期进一步的研究损伤机制奠定理论基础。

综上所述，4周模拟失重可以引起雌性大鼠DRG损伤，为尾部悬吊大鼠作为模拟失重的实验模型提供更多实验依据。但本实验未进行雌雄性别之间的比较，后期需对性别因素进行研究。对于长时间(>4周)悬吊大鼠模型DRG改变的情况、失重条件去除后损伤是否可逆还有待于后期进一步研究。

[1] Blaber E，Marcal H，Burns B P. Bioastronautics: the influence of microgravity on astronaut health [J]. Astrobiology, 2010,10(5):463 -474.

[2] Ren X L, Zhang R, Zhang Y Y,etal. Nitric oxide synthase activity in the abdominal aorta of rats is decreased after 4 weeks of simulated microgravity [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2011, 38(10):683-687.

[3] Jojo V S, Jeffrey L, Scott P,etal. Back pain in space and post-flight spine injury: mechanisms and counter measure development [J]. Acta Astronautica,2013,86:24-38.

[4] Dai Z Q, Wang R, Ling S K,etal. Simulated microgravity inhibits the proliferation and osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Cell Prolif, 2007,40:671-684.

[5] 刘 宁，崔 赓，雷 伟，等. 尾部悬吊大鼠骨质疏松模型骨的微观结构及力学性能变化的研究[J].中国骨与关节杂志,2012,1(2):169-173.[6] Kawano F, Nomura T, Ishihara A,etal. Afferent input-associated reduction of muscle activity in microgravity environment [J]. Neuroscience, 2002,114(4):1133-1138.

[7] Zhang R, Ran H H, Cai L L,etal. Simulated microgravity-induced mitochondrial dysfunction in rat cerebral arteries [J]. FASEB J, 2014,(6):1134-1135.

[8] Williams D, Kuipers A, Mukai C,etal. Acclimation during space flight: effects on human physiology [J]. CMAJ, 2009, 180(13), 1317-1323.

[9] Miranda-Saksena M, Boadle R A, Armati P,etal. In rat dorsal root ganglion neurons, herpes simplex virus type 1 tegument forms in the cytoplasm of the cell body [J]. J Virol, 2002, 76(19):9934-9951.

[10] Ishihara A, Yamashiro J, Matsumoto A,etal. Comparison of cell body size and oxidative enzyme activity in motoneurons between the cervical and lumbar segments in the rat spinal cord after spaceflight and recovery[J]. Neurochem Res,2006,31(3):411-415.

[11] Morey-Holton E R, Globus R K.Hindlimb unloading rodent model: technical aspects [J].J Appl Physiol, 2002,92(4):1367-1377.

[12] Ren J C, Fan X L, Song X A,etal. Prolonged hindlimb unloading leads to changes in electrophysiological properties of L5 dorsal root ganglion neurons in rats after 14 days [J]. Muscle Nerve,2012,45(1):65-69.

(2015-03-24收稿 2014-04-24修回)

(责任编辑 梁秋野)

Effects of simulated weightlessness on DRG in female rats

REN Ningtao1, ZHANG Heng1, LI Jie2, LEI Wei4, ZHANG Ran3, ZHANG Yonggang1,and CUI Geng1.

1.Orthopedics Department， 2.Gynecology Department， 3.Cardiology Department, General Hospital of PLA， Beijing，100853，China；4. Orthopedics Department, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To observe the effect of simulated weightlessness on DRG in female rat model. Method 80 female Sprague-Dawley rats were randomly designated as HU groups (n=40) and normal control(NC) groups (n=40). Four weeks later, the L5 DRG was excised, lumbar 5 DRG were stained with HE staining, the myelin of DRG was observed by using immunohistochemistry. TEM method aimed to observe the DRG myelin and mitochondria. Results HE staining showed that, in HU groups, the arrangement between cells in DRG were slightly loose, some ganglion cells and satellite cells were separated. IOD in NC groups was 0.573±0.007, which was lower than in HU groups (0.802±0.009)(P<0.05). In HU group, the structure of myelin was disorderly and twisted. Mitochondria in HU group were swollen and deformed obviously. Conclusions Stimulated weightlessness can cause the damage changes in the DRG myelin and mitochondria. These suggests that simulated weightlessness can cause damage in female rat DRG.

simulated weightlessness；dorsal root ganglion； animal model

航天医学基础与应用国家重点实验室开放基金(SMFA15K03)；武器装备预研基金(9140A17040109JB1003)

任宁涛，硕士研究生， E-mail：ningtaoren@163.com

100853 北京，解放军总医院：1.骨科，2.妇产科，3.心内科；4.710032 西安，第四军医大学西京医院骨科

崔 赓，E-mail：cuigeng@aliyun.com

R856