n-3多不饱和脂肪酸对大鼠脑缺血再灌注影响及其机制

武警陕西省总队医院(西安710054)

王 军 曹 艳 常 江 蒋 敢



n-3多不饱和脂肪酸对大鼠脑缺血再灌注影响及其机制

武警陕西省总队医院(西安710054)

王 军曹 艳常 江蒋 敢

目的：观察n-3多不饱和脂肪酸对脑缺血再灌注损伤的影响并探讨其机制。方法：成年雄性SD大鼠54只，随机分为假手术组、正常饮食组和高n-3多不饱和脂肪酸饮食组。大鼠喂食6周后，正常饮食组和高n-3多不饱和脂肪酸饮食组的大鼠通过颈内动脉线栓法进行局灶性缺血再灌注损伤。缺血2h再灌注24h后进行神经功能损害评分、脑梗死体积测定、脑组织中丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量测定、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定。假手术组行手术过程但不行缺血处理。结果：高n-3多不饱和脂肪酸饮食组大鼠较正常饮食组在缺血再灌注24h后的神经功能损害评分明显降低，脑梗死体积明显减小，脑组织中MDA和8-OHdG水平显著下降。SOD、CAT和GSH-Px活性在高n-3多不饱和脂肪酸饮食组大鼠较正常饮食组显著升高。结论：高n-3多不饱和脂肪酸饮食可减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤。抗氧化应激能力升高可能参与n-3多不饱和脂肪酸的脑保护作用。

大量统计调查表明,进食鱼油等富含n-3多不饱和脂肪酸的饮食可显著减少脑中风的发生率和病死率。近来的报道也指出,n-3多不饱和脂肪酸对脑缺血损伤有良好的保护作用[1]。尽管有报道指出n-3多不饱和脂肪酸的抗炎效应被认为是其脑保护作用的机制，但是n-3多不饱和脂肪酸对离体培养的神经元以及神经胶质细胞等均有显著地保护作用,这提示n-3多不饱和脂肪酸可直接作用于神经组织细胞起到保护作用[2-3]。氧化应激是神经细胞在脑缺血再灌注之后发生的一个主要病理改变,可明显导致神经细胞损伤[4]。n-3多不饱和脂肪酸不仅可以改变细胞膜的脂质构成,而且可通过细胞内代谢来调节细胞的多种功能[5]。目前尚不清楚n-3多不饱和脂肪酸是否可以增强脑的抗氧化应激能力,从而保护脑功能。本研究在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型观察了n-3多不饱和脂肪酸的脑保护效应以及抗氧化应激作用。

材料和方法

1 材 料 54只健康成年雄性SD大鼠,由第四军医大学动物实验中心提供。丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性试剂盒也由南京建成生物工程研究所提供。实验常用试剂均为国产分析纯试剂。

2 动物分组和处理 动物随机分为假手术组(S组)、正常饮食组(N组)、高n-3多不饱和脂肪酸组(F组)，每组18只。正常饮食组给予常规饮食,饮食中n-3多不饱和脂肪酸含量较低(0.4%)。高n-3多不饱和脂肪酸组在正常饮食中加入鱼油,增加n-3多不饱和脂肪酸含量达1.8%。大鼠喂养6周后行脑缺血再灌注损伤。S组大鼠行动脉分离手术而不进行线栓阻断。脑缺血再灌注大鼠模型制备参照Longa等方法[6]。大鼠经水合氯醛麻醉后，仰卧固定,颈正中切口分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,在颈外动脉分叉处结扎颈总动脉，近心端结扎颈外动脉,颈内与颈外动脉交叉处剪一小口,插入处理后的尼龙线,遇阻力停止,2h后拔出尼龙线,进行再灌注。随后缝合手术切口,待大鼠麻醉清醒后单笼喂养,24 h后进行检测。

3 观察项目 ①神经功能评价：按照Bederson的6级评分标准对再灌注24h之后的大鼠神经功能行为进行评分。0分,无可见神经功能损失；1分,左前爪不能伸直；2分,行走时间断向左侧倾斜；3分,向左侧持续转圈；4分，向左侧倾倒；5分,不能行走。②脑梗死体积测定：行为学评价完毕后,每组取出6只大鼠,麻醉后迅速取脑,冰盐水冷却后,1 mm厚度连续做脑组织冠状切片,放入2%TTC溶液中于37℃孵育30 min,再用10%甲醛固定,随后组织切片照相,用图像分析软件计算梗死面积,各片的梗死面积之和乘以脑片厚度,得出脑梗死体积。③氧化应激检测：行为学评价完毕后,各组另12只大鼠麻醉后，迅速取脑，选取脑梗死区域组织，制备脑组织匀浆，匀浆液经低温离心后取上清用于丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平检测。MDA和8-OHdG检测采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行，操作步骤按照试剂盒使用说明书进行。脑组织匀浆中的SOD、CAT和GSH-Px的活性检测采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行。上清中蛋白水平采用BCA蛋白定量方法进行。

结 果

1 神经功能学评价和脑梗死体积 见表1。S组大鼠未见明显的神经功能损害和脑梗死，与之相比，N组和F组大鼠在脑缺血再灌注后均出现明显的神经功能损害症状，评分显著增高(P<0.01)，脑梗死体积也显著增大(P<0.01,n=6)。与N组相比，F组的大鼠的神经功能评分均显著下降(P<0.05,n=18)，脑梗死体积也显著减少(P<0.05,n=6)。

表1 高n-3多不饱和脂肪酸饮食对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

注：与S组比较，*P<0.01；与N组比较，△P<0.05

2 氧化应激检测 见表2。与S组相比，N组和F组大鼠的脑组织中MDA和8-OHdG水平均显著升高(P<0.01,n=12)。与N组相比，F组大鼠脑组织中MDA和8-OHdG水平降低，具有显著性差异(P<0.05,n=12)。与S组相比，N组中SOD、CAT、GSH-Px的活性显著下降(P<0.01，n=12)。F组大鼠的脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活性较N组显著提高(P<0.05，n=12)。

表2 高n-3多不饱和脂肪酸饮食对缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激的影响

注：与S组比较，*P<0.01；与N组比较，△P<0.05

讨 论

本研究明确了n-3多不饱和脂肪酸对脑缺血再灌注的改善作用，并指出n-3多不饱和脂肪酸发挥保护作用与抗氧化应激有关。在以往许多脑缺血损伤的动物模型中，n-3多不饱和脂肪酸被证实对脑缺血损伤具有一定的保护作用[7]。本研究通过饮食给予n-3多不饱和脂肪酸6周而达到了显著的减轻脑缺血再灌注损伤的效果，这进一步说明n-3多不饱和脂肪酸具有脑保护作用。同时，这也提示口服n-3多不饱和脂肪酸或可成为一个安全、有效、方便、经济的减轻脑缺血再灌注损伤的方法。

n-3多不饱和脂肪酸具有广泛的生物学效应，它可改变细胞膜磷脂的构成，间接改变细胞内脂质信号途径和膜的反应性。n-3多不饱和脂肪酸可抑制血小板TXA2形成，抑制血小板聚集和血栓形成。n-3多不饱和脂肪酸还可通过竞争环氧酶而减少炎性介质的生成，起到抗炎和免疫调节作用[8]。本研究则明确了n-3多不饱和脂肪酸在大鼠缺血再灌注脑组织具有抗氧化应激作用。MDA和8-OHdG分别是脂质过氧化和 DNA氧化损伤的标记物，其水平可反映机体氧化应激程度[9]。MDA和8-OHdG升高表明缺血再灌注诱导诱导氧化应激的发生。高n-3多不饱和脂肪酸饮食则减轻了缺血再灌注诱导的MDA和8-OHdG升高，说明n-3多不饱和脂肪酸具有一定的抗氧化应激的能力。

氧化应激是机体在各种有害刺激作用下,体内高活性分子如活性氧自由基生成过多，超出机体抗氧化能力，导致组织的氧化损伤。程畅河等[10]报道：厚朴酚能通过抗氧化作用,显著缩小脑缺血再灌注后的梗死范围,降低脑水肿的程度,减少脑组织氧自由基的生成以及Caspase-3的活性。正常机体存在抗氧化系统，包括SOD、CAT、GSH-Px等酶。这些酶可清除氧自由基，防止氧化损伤[11]。本研究发现,缺血再灌注24h后组织中SOD、CAT、GSH-Px活性显著下降，这可能是大量氧自由基造成的酶活性抑制。高n-3多不饱和脂肪酸饮食组的大鼠脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活性较正常饮食组明显升高，这可提高脑组织抗氧化能力，减少氧化损伤和脑组织损害。增强抗氧化能力可能是n-3多不饱和脂肪酸保护脑组织的一个重要原因。n-3多不饱和脂肪酸抗炎和抗血栓形成的作用均可显著改善缺血再灌注脑组织的氧化应激程度，从而保护脑组织。另一方面，n-3多不饱和脂肪酸可能直接调控神经组织细胞中SOD、CAT、GSH-Px的表达和活性，产生抗氧化作用。其具体的作用机制尚有待进一步明确。

脑缺血再灌注损伤一直是临床面临的一个难题，确定有效的防护措施十分必要。目前，有多种药物被报道可起到减轻脑缺血再灌注损伤的效果。本研究表明，n-3多不饱和脂肪酸减轻脑缺血再灌注损伤，这为临床上防治脑缺血再灌注损伤提供了一种可能的非药物性治疗举措。

[1] Turunen AW,Verkasalo PK,Kiviranta EH,etal.Vartiainen,Mortality in a cohort with high fish consumption[J].Int J Epidemiol,2008,37(5)：1008-1017.

[2] Lalancette-Hebert M,Julien C,Cordeau P,etal.Accumulation of dietary docosahexaenoic acid in the brain attenuates acute immune response and development of postischemic neuronal damage[J].Stroke,2011,42(10)：2903-2909.

[3] Zhang M,Wang L,Mao R,etal.Omega-3 fatty acids protect the brain against ischemic injury by activating Nrf2 and upregulating heme oxygenase 1[J].J Neurosci,2014,34(5)：1903-1915.

[4] 徐 运.氧化应激与脑缺血再灌注损伤[J].中国卒中杂志,2008(3)：195-197.

[5] 张俊杰,周克元,蔡 春.n-3脂肪酸代谢产物抗炎作用的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2011(1)：20-27.

[6] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,2011,20(1)：84-91.

[7] Mayurasakorn K,Williams JJ,Ten VS,etal.Deckelbaum, Docosahexaenoic acid: brain accretion and roles in neuroprotection after brain hypoxia and ischemia[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2011,14(2)：158-67.

[8] Miles EA,Calder PC.Influence of marine n-3 polyunsaturated fatty acids on immune function and a systematic review of their effects on clinical outcomes in rheumatoid arthritis[J].Br J Nutr,2012,107：171-184.

[9] 王秋林,王浩毅,王树人.氧化应激状态的评价[J].中国病理生理杂志,2012,24(10)：2069-2074.

[10] 程畅河,叶锡勇.厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注的保护作用[J].陕西中医,2010,31(4)：501-503.

[11] Valko M,Leibfritz DJ,Moncol M,etal.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,39(1)：44-84.

(收稿：2015-01-15)

脑 再灌注损伤 氧化性应激 脂肪酸类,ω-3

R743.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.006