建立双抗体夹心法ELISA定量检测戊型肝炎p179疫苗

文继月，孟多佳，封晔，田赛，时成波，孟继鸿

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130062)

·论 著·

建立双抗体夹心法ELISA定量检测戊型肝炎p179疫苗

文继月1，孟多佳2，封晔1，田赛1，时成波2，孟继鸿1

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130062)

目的:建立双抗体夹心法ELISA检测HEV抗原，用于定量检测戊型肝炎p179疫苗生产过程中初制品、半成品和疫苗成品。方法：将单克隆抗体3G1、5G5、1G10、3A10和4E9分别进行辣根过氧化物酶标记，通过竞争ELISA检测确定最佳抗体配对用于建立双抗体夹心法ELISA，对p179生产过程中所得制品进行抗原定量检测。结果：5种单克隆抗体可以分成两组，分别针对p179疫苗抗原上的两种不同抗原表位，选择3G1为包被抗体、4E9为酶标抗体建立的双抗体夹心法ELISA具有良好的敏感性和特异性，对p179抗原检测的最低浓度可至15.6 ng·ml-1。该方法能够有效检测p179疫苗生产过程中的初制品、半成品和疫苗成品的抗原含量，反映抗原纯化各步骤的得率。结论:建立的双抗体夹心法ELISA可作为p179疫苗生产过程中的抗原检测方法，这有助于定量检测p179疫苗生产过程中的抗原成分。

戊型肝炎病毒； 疫苗； 重组蛋白； 单克隆抗体； 双抗体夹心法酶联免疫吸附试验

Quantitative detection of the hepatitis E p179 vaccine with a double antibody sandwich eLISA

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的、主要经消化道传播的一种病毒性肝炎，呈全球分布，常因水源污染而发生大流行[1]，病死率高，在孕妇[2]中可达20%以上[3]。近年发现在器官移植受体中可发生类似乙型肝炎和丙型肝炎的慢性HEV感染[4-5]。为了有效控制和预防HE，加强对HE疫苗的研究势在必行。HEV可分为1、2、3、4共4个基因型，我国流行的是第4基因型，不同基因型之间的抗原性有一定的差异[6]。Meng等[7]将HEV中和抗原表位定位于ORF2 C端编码的452-617位氨基酸之间(166个氨基酸)，并分别制备了不同基因型p166的单克隆抗体(McAb)。在p166重组蛋白的研究基础上利用大肠杆菌可溶性表达了含有中和抗原表位的HEV重组蛋白p179(aa452-630)，p179作为HE疫苗已获SFDA批准开展临床试验。

在HE疫苗生产、检定、存储过程中疫苗抗原的检测是必不可少的，特别是在疫苗纯化过程中的粗制品中尚含有大量的杂蛋白，无法用蛋白定量的方法检测，需要一种简单有效的免疫学检测手段。为此我们将多个来源于p166的McAbs进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，筛选合适的配对抗体，建立双抗体夹心法ELISA，用于HE p179疫苗生产过程中初制品、半成品和疫苗成品的抗原检测和检定。

1 材料与方法

1.1 抗原和单克隆抗体

1.1.1抗原制备 将HEV缅甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美国株(AF035437)、中国株(AJ272108)编码ORF2 p166(aa 452-617)的基因片段以及HEV缅甸株和中国株编码ORF2 p146(aa460-605)的基因片段插入PET28a载体(Pharmacia产品)构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109菌株(Promega产品)，表达6His-ORF2融合蛋白，经镍柱(Pharmacia产品)纯化的融合蛋白分别命名为p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn、p146Bur、p146Chn，由东南大学医学院实验室保存。p179疫苗生产过程中的初制品、半成品及成品由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

1.1.2单克隆抗体制备 以HEV第1基因型巴基斯坦株HEV ORF2基因编码蛋白C端452-617aa重组蛋白(p166Sar)为免疫原，常规方法制备鼠源McAb，获得特异性McAb 3G1;以HEV第4基因型中国株p166蛋白(p166Chn)为免疫原，获得特异性鼠源McAb 5G5、1G10，以上McAbs由东南大学医学院实验室保存。以HEV第4基因型中国株ORF2基因编码蛋白C端439-617aa(HE疫苗p179)为免疫原，获得特异性鼠源McAbs 3A10、4E9，由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

1.1.3单克隆抗体的纯化 应用亲和层析法纯化各单克隆抗体，SDS-PAGE分析抗体纯度，Lowry法测定蛋白含量。

1.1.4HRP标记抗HEV单克隆抗体 采用改良的过碘酸钠法[8]将HRP(KPL公司)标记单克隆抗体3G1、1G10、5G5、4E9、3A10。

1.2 单克隆抗体竞争抑制试验

将p179作为包被抗原，利用直接法ELISA和方阵滴定确定包被抗原、McAbs和酶标McAbs的最佳稀释浓度，使得竞争抑制试验中参比对照孔的OD450/630值接近1.0，处于线性变化的敏感范围。试验条件确定后取最佳稀释浓度的p179包被ELISA板，分为5个实验组，每组每孔分别加入由1% casein PBS稀释的5株单抗，100 μl·孔-1，另外设对照组，每孔加入100 μl的1% casein PBS作为对照，37 ℃孵育45 min，吸弃液体后每组每孔分别加入5株HRP标记单抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗涤5次后加入显色剂，37 ℃温育10 min，2 mol·L-1硫酸50 μl终止反应。于酶标仪读取OD450/630的值，计算抑制率(抑制率=1-抑制孔OD值/对照孔OD值)，抑制率大于50%判断为抑制试验阳性，表明2种McAbs针对的抗原表位相同或相关；反之，则2种McAbs针对的抗原表位不同或无关。

1.3 双抗体夹心法ELISA的建立

亲和层析法纯化的单克隆抗体3G1、1G10、5G5、4E9、3A10按已确定的最佳稀释浓度分别溶解于0.05 mol·L-1碳酸包被缓冲液(pH 9.6)中，100 μl·孔-1包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗涤2遍，每孔中分别加入等系列稀释的p179抗原(1 mg·ml-1开始倍比稀释)。37 ℃温育45 min；洗涤5次，扣干，每孔分别加入最佳稀释浓度各酶标单克隆抗体3G1、1G10、5G5、4E9、3A10，37 ℃温育45 min；洗涤5次，扣干，加入显色剂，37 ℃温育10 min后加终止液50 μl(2 mol·L-1H2SO4)终止，于酶标仪上读取OD450/630的值。

1.4 双抗体夹心法ELISA的方法验证

1.4.1特异性验证 用所建立的双抗体夹心法ELISA检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原重组疫苗验证该方法的特异性。

1.4.2灵敏度验证 以所建立的双抗体夹心法ELISA检测4种基因型p166、基因1型和4型p146(aa460-605)以及p179疫苗(aa439-617)，验证该方法的灵敏度。

1.5 双抗体夹心法ELISA检测p179疫苗纯化过程中各步骤的得率

纯化3G1以0.05 mol·L-1碳酸包被缓冲液(pH 9.6)稀释后包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗涤2遍，将p179纯化过程各步骤样品以1% casien PBS倍比稀释，1 mg·ml-1的p179原液同样稀释作对照，100 μl·孔-1，37 ℃温育45 min，PBST洗板5次，扣干，每孔加1% casein PBS稀释的工作浓度的HRP标记的4E9，37 ℃温育45 min，PBST洗板5次，扣干。加入显色剂，37 ℃温育10 min后加终止液终止，于酶标仪上读取OD450/630的值，与已知浓度的p179原液各稀释度的OD值作对比，计算各样品中的蛋白含量和纯化过程中各步骤的得率。

1.6 双抗体夹心法ELISA检测p179疫苗成品

纯化3G1以0.05 mol·L-1碳酸包被缓冲液(pH 9.6)稀释后包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗涤2遍，将各p179疫苗(20、30、40 μg·ml-1)以1% casien PBS倍比稀释，100 μl·孔-1，37 ℃温育45 min，PBST洗板5次，扣干，每孔加1% casein PBS稀释的工作浓度的HRP标记的4E9，37 ℃温育45 min，PBST洗板5次，扣干。加入显色剂，37 ℃温育10 min后加终止液终止，于酶标仪上读取OD450/630的值。

2 结 果

2.1 单克隆抗体之间的竞争抑制作用

以p179抗原包被微孔板，将5种McAbs进行互相的竞争抑制试验，结果见表1。竞争抑制ELISA的结果基本可以分为两种类型，一种是McAbs之间能够相互竞争，如McAbs 1G10与3G1、1G10与5G5、3G1与5G5；另一种结果是McAbs之间不能相互竞争，如1G10与4E9、1G10与3A10、3G1与4E9、3G1与3A10、5G5与4E9、5G5与3A10。这些结果说明在p179抗原上至少存在两种抗原表位。

2.2 双抗体夹心法ELISA的建立

经正交法优化单克隆抗体包被浓度和抗原、酶标抗体使用浓度以及反应条件后，将5株McAbs和相应的酶标McAbs进行分别组合(能相互竞争者除外)，建立双抗体夹心法ELISA，对系列稀释的p179(1 mg·ml-1从1∶20 000开始倍比稀释)进行检测，结果如表2所示。以3G1和HRP-4E9为基础建立的双抗体夹心法ELISA对系列稀释的p179所检出的OD平均值最高，从而建立了以3G1和HRP-4E9为基础的HEV重组抗原p179的双抗体夹心法ELISA。

表1 不同单克隆抗体之间的竞争抑制作用

Tab 1 Inhibitory effect of competition between different McAbs

2.3 双抗体夹心法ELISA的灵敏度和特异性

由3G1和HRP-4E9建立的双抗体夹心法ELISA经正交法优化反应条件后，对倍比稀释后的4种基因型p166(p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn)、p146w01、p146Chn、p179疫苗进行检测，结果7种抗原均能检测，OD值随抗原稀释度升高而逐渐下降，其对p179的检出最低浓度可至15.6 ng·ml-1。表明该方法具有良好的灵敏度，见图1A；而冻干甲型肝炎减毒活疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原重组疫苗检测结果的OD值均在0.1以下，表明该方法特异性较高，见图1B。

表2 双抗体夹心法ELISA对p179的检测结果

Tab 2 The detection of p179 by double antibody sandwich ELISA

图1 双抗体夹心法ELISA灵敏度(A)和特异性(B)

Fig 1 The sensitivity(A)and specificity(B)of double antibody sandwich ELISA

2.4 双抗体夹心法ELISA检测p179疫苗纯化过程中的抗原回收率

双抗体夹心法ELISA对p179疫苗纯化工艺中各纯化过程中洗脱液进行检测，将已知浓度的p179原液系列稀释作为阳性对照，根据每组OD值的平均值对各洗脱液的蛋白含量及各纯化方式的回收率进行估算，并与SDS-PAGE蛋白定量法所计算的蛋白回收率作对比，结果如表3所示。p179纯化过程中的各洗脱液均能检出，通过与已知浓度的p179原液的各稀释度所对应的OD值对比并计算蛋白质的回收率，与SDS-PAGE蛋白质定量所得蛋白回收率数据非常接近。

表3 双抗体夹心法ELISA对p179纯化洗脱液的检测结果(OD值)

Tab 3 The detcetion of elution liquids during purified process of p179 by double antibody sandwich ELISA(OD)

2.5 双抗体夹心法ELISA检测不同浓度的p179铝吸附疫苗

双抗体夹心法ELISA分别多次检测20、30、40 μg·ml-1的p179铝吸附疫苗成品解离后抗原含量，结果如表4所示，各浓度的p179疫苗均能与单抗反应，随p179疫苗浓度的下降OD值亦逐渐降低，可以体现p179疫苗之间的浓度差异。

表4 双抗体夹心法ELISA p179铝制剂疫苗的检测结果(OD值)

Tab 4 The detection of p179 vaccine by double antibody sandwich ELISA(OD)

3 讨 论

目前已有3种HE疫苗进入临床试验阶段或已上市：Purcell等[9]利用杆状病毒表达HEV ORF2片段编码的56 kD的重组蛋白；我国厦门大学利用大肠杆菌以包涵体形式表达HEV 1型ORF2片段编码的重组蛋白p239[10-11]；我们在p166重组蛋白的研究基础上利用大肠杆菌可溶性表达了含有中和抗原表位的HEV重组蛋白p179(aa439-617)，能够诱导动物产生高滴度的特异性HEV中和抗体，目前已完成Ⅰ期临床试验。

双抗体夹心法是检测特异性抗原有效的方法，它的原理是将高度特异的单克隆抗体包被于微孔板，专一地捕获抗原,然后与酶标单克隆抗体结合，再加入底物液显色。双抗体夹心法检测抗原阴性本底很低，特异性好，便于结果的判断[12]。在本研究中首先分别应用针对HEV ORF2重组蛋白的特异性McAbs进行纯化并用HRP标记，以此建立竞争抑制ELISA进行单抗的筛选，将针对两种不同抗原表位的McAbs分别作为包被抗体和酶标抗体，才有可能成功建立双抗体夹心法ELISA，其结果表明部分McAbs之间可以相互竞争与p179结合，表示它们针对相同的抗原表位;而部分McAbs之间完全不能竞争，可同时与p179结合，表示其针对不同的抗原表位。综合以上结果，p179上至少存在2种或2种以上抗原表位，两种抗原表位在空间结构上无相互影响，满足建立双抗体夹心法ELISA检测抗原的理论基础。目前尚无市售HEV ORF2重组蛋白抗原检测的试剂盒，也没有统一的快速准确的方法对HEV ORF2重组蛋白抗原进行检测。我们设计多种实验对本检测方法的灵敏度和特异性进行评价，用本方法检测多个HEV ORF2重组蛋白抗原，阳性率100%，特别是对等量的不同基因型p166抗原无差异检出。另外，在疫苗储存过程中是否会出现疫苗抗原性的下降国内外均未见相关报道。本研究使用多组McAbs并相互比较所建立的双抗体夹心法ELISA，可快速、准确检测p179纯化过程中初制品、半成品以及成品，同时能进行抗原定量，且重复性好。

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WEN Ji-yue1，MENG Duo-jia2，FENG Ye1，TIAN Sai1，

SHI Cheng-bo2，MENG Ji-hong1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.ChangchunInstituteofBiologicalProductsCo.，LTD，Changchun130062，China)

Objective： To establish a double antibody sandwich ELISA for detection of hepatitis E virus antigen，and quantitative detection of p179 vaccine in early， semi-finished and finished products during vaccine production process. Methods: McAbs 3G1， 5G5， 1G10， 3A10 and 4E9 were prepared， conjugated with horseradish peroxidase and were used in a competitive inhibitory ELISA. Then， the appropriate paired McAbs were chosen to the establishment of the double antibody sandwich ELISA. Serial dilutions of p179 vaccine were used for the optimization of the double antibody sandwich ELISA and then the in-process p179 vaccine products were detected and quantified with the established assay. Results: Double antibody sandwich ELISA that can detect p179 vaccine during production process was established and optimized. McAbs 3G1 was selected as a coating antibody and 4E9 as an enzyme-conjugated antibody. Repeated detection of p179 using the sandwich ELISA has shown appreciable specificity and sensitivity，with a minimum detectable concentration of p179 vaccine up to 15.6 ng·ml-1. No cross reactivity was observed with both freeze-dried hepatitis A attenuated live vaccine and Hepatitis B virus surface antigen recombinant vaccine. Conclusion: The established double antibody sandwich ELISA can be used for the detection and quantitation of p179 antigen during vaccine production process．

hepatitis E virus; vaccine; recombinant protein; monoclonal antibody; double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

2015-04-14

2015-04-20

国家863疫苗重点项目(2006AA02A235); 东南大学国家大学生创新训练计划项目(1210286097)

文继月(1978-)，女，安徽六安人,在读博士研究生。E-mail:wenjiyue139@aliyun.com

孟继鸿 E-mail:jihongmeng@163.com

文继月,孟多佳,封晔,等.建立双抗体夹心法ELISA定量检测戊型肝炎p179疫苗[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):501-506.

R392-33

A

1671-6264(2015)04-0501-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．003