多耐药肺结核患者特异性细胞免疫失衡与调节性T细胞CD4+CD25+CD127low有关

范任华，向延根，杨励，刘艳科，陈平圣，尹柯，许忆新，封文军，傅满姣，吴佳玲，王雷，齐志强，喻容，张婷

(1.长沙市中心医院，湖南 长沙 410004； 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

·论 著·

多耐药肺结核患者特异性细胞免疫失衡与调节性T细胞CD4+CD25+CD127low有关

范任华1，向延根1，杨励1，刘艳科1，陈平圣2，尹柯1，许忆新1，封文军1，傅满姣1，吴佳玲1，王雷1，齐志强1，喻容1，张婷1

(1.长沙市中心医院，湖南 长沙 410004； 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

目的:探讨调节性T细胞CD4+CD25+CD127low、CD4+及CD8+T细胞在多耐药结核患者中的免疫调节作用。方法:采取30例健康体检者(HD)、30例非耐药初治肺结核(S-TB)患者及30例多耐药结核病(MDR-TB)患者2ml肝素抗凝外周静脉血，经CD3、CD4、CD8、CD25、CD127流式抗体标记后Beckman流式细胞仪计数各组CD4+CD25+CD127low、CD3+、CD4+、CD8+百分比含量，计算CD4/CD8值。结果:MDR-TB组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞百分比含量明显高于HD组与S-TB组(P=0.000)，MDR-TB组CD4+T细胞百分比含量明显低于HD组与S-TB组(P<0.05)，MDR-TB组CD8+T细胞百分比含量与HD组与S-TB组相比明显上升(P<0.05)，MDR-TB组CD4/CD8值明显低于HD组与S-TB组(P<0.001)；线性回归分析发现：HD组中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞百分比含量与CD3+、CD4+、CD8+T细胞及CD4/CD8值均无相关性(P>0.05)，非耐药初治肺结核患者CD4+CD25+CD127low调节性T细胞百分比含量与CD3+、CD4+T细胞无相关性(P>0.05)、与CD8+T细胞存在正相关(r=0.419，P=0.011)、与CD4/CD8值存在负相关(r=-0.519，P=0.002)，耐药结核病患者CD4+CD25+CD127low调节性T细胞百分比含量与CD3+T细胞无相关性(P>0.05)、与CD4+存在负相关(r=-0.476，P=0.004)、与CD8+T细胞存在正相关(r=0.638，P=0.000)、与CD4/CD8值存在负相关(r=-0.776，P=0.000)。结论:随着肺结核病程的发展，外周血中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞逐渐上调，特异性细胞免疫水平下调，二者之间存在相关性，调节性T细胞可能通过抑制结核患者特异性细胞免疫应答来影响肺结核病的进程。

调节性T细胞CD4+CD25+CD127low； CD4+T细胞； CD8+T细胞； 多耐药肺结核

调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)CD4+CD25+CD127low是一群在胸腺内发育成熟的控制自身免疫反应和免疫耐受的T淋巴细胞[1]。Treg在免疫调节中发挥重要作用，成为近年来免疫学的研究热点。Treg被认为参与多种肿瘤的免疫平衡状态调节，一般认为Treg抑制患者特异性免疫的产生[2]。此外，Treg还与多种慢性感染性疾病的发生有关[3]。肺结核外周血中CD4+CD25+T细胞数量显著高于健康对照且与患者的细胞免疫状态相关，CD4+CD25+Treg在肺结核发生中可能起重要作用[4]。同样，CD4+、CD8+T细胞的特异性在肺结核病的发生发展中发挥重要作用。然而，Treg、CD4+与CD8+T细胞在耐药肺结核病发生中的作用以及它们之间的关系并未弄清楚。为了进一步弄清楚Treg在肺结核患者中的特异性细胞免疫调节作用，我们对30例健康体检人群(HD)、30例非耐药初治肺结核(S-TB)患者以及30例多耐药肺结核(MDR-TB)患者外周血中Treg、CD4+、CD8+T细胞的免疫调节作用进行体外分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象选择2013年11月至2014年9月长沙市中心医院住院患者，MDR-TB组30例，其中男18例，女12例，平均年龄(47.2±14.2)岁；S-TB组30例，其中男20例，女10例，平均年龄(52.8±15.7)岁；HD 30例，其中男18例，女12例，平均年龄(46.7±14.3)岁。临床诊断根据临床症状、体征、X线胸片、CT扫描、痰菌检查，均符合中华医学会结核病分类与诊断标准[5]，S-TB病人、MDR-TB病人根据药敏结果确诊后采集外周血，HD组来源于经筛查身体各项指标正常的体检人群，空腹采血。

1.2 试剂和仪器

采用Beckman-Coulter Epics XL流式细胞仪，CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE、IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE、溶血剂OptiLyse C均购自美国Beckman-Coulter公司。

1.3 方法

取2ml静脉血，肝素抗凝，混匀，各取50μl全血于3支测定管，第l管加入IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE，第2管加入CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE单克隆抗体量均为20μl，第3管加入CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5组合抗体试剂20μl。标记抗体和抗凝血混匀，在室温、避光15min后每管400μl溶血剂OptiLyse C溶解红细胞1h，用侧向散射光(SS)和前向散射光(Fs)圈门选取淋巴细胞群，统一设定流式细胞术收集淋巴细胞数量30000个为停止条件，以IgGl-FITC/IgGl-PE/IgGl-PC5为Treg同型对照。分别检测CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+、CD8+T细胞百分比含量。

1.4 统计学处理

用统计分析软件SPSS19.0对检测结果进行分析，计量资料以均数±标准差表示、各组间差异比较分别用One-Way ANOVA分析，性别、年龄差异比较分别采用χ2检验、方差分析，CD4+CD25+CD127lowTreg与CD3+、CD4+、CD8+百分比含量以及CD4/CD8值之间的相关分析采用线性回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究队列入组标准

纳入标准：所有入组研究对象均无心、肝、肾等脏器合并症及其他感染，无糖尿病、自身免疫相关性或免疫性疾病，3个月内未用过免疫抑制剂及激素等药物。各组间性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=0.340，P=0.844>0.05；F=1.54，P=0.220>0.05)。

2.2 MDR-TB患者与HD及S-TB患者外周血CD4+CD25+CD127low Treg水平比较

MDR-TB组外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T细胞总数的(10.63±3.85)%，高于 S-TB组的(7.17±2.94)%以及HD组的(3.03±1.07)%，差异有统计学意义(F=11.50，P=0.000)。

2.3 MDR-TB患者与HD及S-TB患者外周血CD4+、CD8+T细胞水平，CD4/CD8值比较

与HD组相比，S-TB组外周血CD3+百分比数量上升、MDR-TB组CD3+百分比数量下降，差异无统计学意义(P>0.05)；与HD组相比，S-TB组外周血CD4+百分比数量下降，差异无统计学意义(P=0.629>0.05)，MDR-TB组CD4+百分比数量明显下降(P=0.022<0.05)；与HD组相比，S-TB组外周血CD8+百分比含量上调(P=0.05)，MDR-TB组CD8+百分比含量明显上升，差异有统计学意义(P=0.007<0.05)；与HD组相比，S-TB组外周血CD4/CD8值下降，差异有统计学意义(P=0.027<0.05)，MDR-TB组CD4/CD8值明显下降，差异有统计学意义(P=0.000)。见表1。

注：CD4+MDR-TB组与HD组比较，P<0.05； S-TB组与HD组比较，P>0.05; MDR-TB组与S-TB组比较，P<0.05。CD8+MDR-TB组与HD组比较，P<0.05； S-TB组与HD组比较，P=0.05; MDR-TB组与S-TB组比较，P>0.05。CD4/CD8值MDR-TB组与HD组比较，P=0.000； S-TB组与HD组比较，P<0.05; MDR-TB组与S-TB组比较，P>0.05

2.4 肺结核患者CD4+CD25+CD127low Treg与CD4+、CD8+细胞水平，CD4+/CD8+值之间的趋势关系

通过对表1中的CD4+CD25+CD127lowTreg与CD3+、CD4+以及CD4/CD8值进行线性回归分析，发现HD中CD4+CD25+CD127lowTreg 百分比含量与CD3+、CD4+、CD8+T细胞及CD4/CD8值均无相关性(P>0.05)；S-TB患者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量与CD3+、CD4+T细胞无相关性(P>0.05)，与CD8+T细胞存在正相关(r=0.419，P=0.011)，与CD4/CD8值存在负相关(r=-0.519，P=0.002)；MDR-TB患者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量与CD3+T细胞无相关性(P>0.05)，与CD4+存在负相关(r=-0.476，P=0.004)，与CD8+T细胞存在正相关(r=0.638，P=0.000)，与CD4/CD8值存在负相关(r=-0.776，P=0.000)。见图1～3。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+T细胞百分含量之间的相关性(r=-0.024，P=0.450)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4+T细胞百分含量之间的相关性(r=-0.09，P=0.317)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD8+T细胞百分含量之间的相关性(r=0.019，P=0.459)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4/CD8值之间的相关性(r=-0.225，P=0.061)

图1 HD外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分含量及CD4/CD8值之间的相关性

Fig 1 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of HD

3 讨 论

T细胞是机体最重要的免疫细胞，其主要功能是介导细胞免疫和调节机体的免疫功能，外周血中T细胞亚群是反映机体细胞免疫状态的指标。本研究结果表明:与HD组相比，S-TB组CD3+T细胞百分比数量略有上升可能是与S-TB患者初次感染结核菌引起CD3+T细胞细胞反应性扩增，而MDR-TB组患者外周血的CD3+T细胞百分比数量略有下降则有可能是耐药结核病患者带菌生存时与体内的CD3+T细胞凋亡消耗有关；与HD组相比，S-TB、MDR-TB组患者外周血的CD4+T细胞百分比数量下降(P<0.05)，表明结核感染会引起体内CD4+Th细胞下降；与HD组相比，S-TB、MDR-TB组患者外周血的CD8+T细胞百分比数量上升，这有可能有两种情况：一是肺结核患者体内的细胞毒性CD8+T细胞反应性扩增以抵抗结核分枝杆菌的入侵，二是CD4+T细胞百分比数量下降导致的CD8+T细胞百分比数量升高；与HD组相比，S-TB、MDR-TB组患者外周血CD4/CD8值显著下降，差异有统计学意义(P<0.001)。MDR-TB、S-TB患者外周血CD4+、CD4/CD8值显著低于HD，提示肺结核CD4+Th细胞免疫功能受到抑制，细胞免疫应答能力下降；与HD组相比，MDR-TB较S-TB患者CD4/CD8值下降更显著，免疫失衡进一步加重。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+T细胞百分含量之间的相关性(r=0.161，P=0.197)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4+T细胞百分含量之间的相关性(r=-0.079，P=0.340)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD8+T细胞百分含量之间的相关性(r=0.419，P=0.011)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4/CD8值之间的相关性(r=-0.519，P=0.002)

图2 S-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分含量及CD4/CD8值之间的相关性

Fig 2 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of S-TB patients

Treg CD4+CD25+CD127low是机体里一种负性调控因子，与自身免疫病[6]、肿瘤[7-8]以及慢性感染[9]免疫抑制有关。研究发现，外科切除治疗空洞型MDR-TB后，Treg数量减少，表明Treg参与了MDR-TB疾病进程[10]。通过检测MDR-TB、S-TB与HD组外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD4/CD8值，发现MDR-TB组CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量明显高于S-TB组与HD组，提示MDR-TB组患者机体受到的免疫抑制明显强于S-TB组与HD组。健康人群的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量与特异性细胞免疫CD3+、CD4+、CD8+以及CD4/CD8值不存在相关性。S-TB CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量与CD8+呈正相关，与CD4/CD8值呈负相关。随结核病程的进展，MDR-TB组患者机体特异性细胞免疫逐渐失衡，CD4+百分比含量、CD4+/CD8+值明显低于S-TB组与HD组，与CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量明显呈负相关，CD8+百分比含量随肺结核病程进展逐渐增高，与CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量呈正相关，提示肺结核患者的特异性的CD4+、CD8+T细胞免疫功能失衡，其免疫功能随病情加重而下降，这可能与患者机体CD4+CD25+CD127lowTreg上调有关，Treg可能通过抑制性的细胞因子[11]、细胞接触和诱导凋亡等方式发挥其免疫抑制的功能，进而间接抑制CD4+、CD8+T细胞免疫[12]。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+T细胞百分含量之间的相关性(r=0.056，P=0.384)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4+T细胞百分含量之间的相关性(r=-0.476，P=0.004)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD8+T细胞百分含量之间的相关性(r=0.638，P=0.000)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD4/CD8值之间的相关性(r=-0.776，P=0.000)

图3 MDR-TB患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量与CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分含量及CD4/CD8值之间的相关性

Fig 3 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of MDR-TB patients

综上所述，CD4+CD25+CD127lowTreg在MDR-TB发生发展发挥重要的负调节作用，深入研究其与特异性免疫之间的关系或许对增强机体免疫力，预防肺结核[13]和攻克MDR-TB是一个潜在的帮助。

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The correlation of the deregulated specific cellular immunity and CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in the multi-drug resistant pulmonary tuberculosis

FAN Ren-hua1，XIANG Yan-gen1，YANG Li1，LIU Yan-ke1，CHEN Ping-sheng2，YIN Ke1，XU Yi-xin1，FENG Wen-jun1，FU Man-jiao1，WU Jia-ling1，WANG Lei1，QI Zhi-qiang1，YU Rong1，ZHANG Ting1

(1.ChangshaCentralHospital，Changsha410004，China; 2.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To study the role of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells， CD4+and CD8+T cells in patients with multidrug-resistant tuberculosis. Methods: 30 cases of healthy donors(HD)，30 cases of patients with susceptible primary tuberculosis(S-TB)，30 cases of patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis (MDR-TB)were involved. 2ml of peripheral venous blood was injected into heparin anticoagulation tube， labeled with the monoclonal antibody of CD3， CD4， CD8， CD25 and CD127. The percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells， CD3+， CD4+and CD8+T cells was counted by using Beckman flow cytometry(FCM)， and the calculation of CD4/CD8 was conducted. Results: The percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in MDR-TB patients was significantly higher than that in the HD group and in the S-TB group(P=0.000)， the percentage of CD4+T cells in MDR-TB group was significantly lower than that in the HD group and in the S-TB group(P<0.05)， and the percentage of CD8+T cells in MDR-TB increased significantly compared with that in the HD group(P<0.05)， the ratio of CD4/CD8 in MDR-TB group was significantly lower than that in the HD group and in the S-TB group(P<0.001). There was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+， CD4+， CD8+and CD4/CD8 in HD by using the method of linear regression analysis(P>0.05). In drug-susceptible TB patients， there was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+and CD4+(P>0.05)， a positive correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD8+(r=0.419，P=0.011)， and a negative correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and CD4/CD8 ratio(r=-0.519，P=0.002). In MDR-TB patients， there was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+(P>0.05)， a positive correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD8+(r=0.638，P=0.000)， and a negative correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD4+(r=-0.476，P=0.004) and CD4/CD8 ratio(r=-0.776，P=0.000). Conclusion: With the development of pulmonary tuberculosis， CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells gradually increase in the peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients， and specific cellular immunity levels decline， there is a correlation in them， CD4+CD25+CD127lowregulator T cells may inhibit specific cellular immune response in MDR-TB patients．

CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells； CD4+T cells； CD8+T cells； multi-drug resistant pulmonary tuberculosis

2015-01-26

2015-03-21

科技重大专项课题资助项目(2013ZX10005004-004)

范任华(1979-)，男，湖南隆回人，主管技师，医学博士。E-mail：fanrenhua04@sina.com

向延根 E-mail：xiangyangen@126.com；杨励 E-mail：yanglicszxyy@163.com

范任华,向延根,杨励,等.多耐药肺结核患者特异性细胞免疫失衡与调节性T细胞CD4+CD25+CD127low有关[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):525-531.

R521

A

1671-6264(2015)04-0525-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．007