99Tc-MDP抑制胶原诱导性关节炎大鼠DKK1表达的研究

顾志琴，王美美

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院风湿免疫科，江苏 南京 210009)

·论 著·

99Tc-MDP抑制胶原诱导性关节炎大鼠DKK1表达的研究

顾志琴1，王美美2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院风湿免疫科，江苏 南京 210009)

目的:观察胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠DKK1的表达及99锝-亚甲基二磷酸盐(99Tc-MDP，商品名：云克)对骨侵蚀的治疗作用，探讨云克治疗骨侵蚀的可能作用机制。方法:建立CIA大鼠模型，分为模型组、甲氨蝶呤(MTX)组、云克小剂量组、云克大剂量组；通过Larsen评分和病理组织形态学评分评价骨质破坏；ELISA法检测关节液和血清DKK1、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平；免疫组化法检测踝关节区滑膜及软骨的DKK1、TNF-α表达；采用方差分析、t检验和相关分析进行统计学处理。结果:云克干预组和MTX组大鼠骨质破坏，血清和关节液DKK1、TNF-α水平，踝关节区滑膜及软骨DKK1、TNF-α表达均低于模型组(P<0.05)；云克干预组骨质破坏、血清和关节液DKK1水平、踝关节区滑膜及软骨DKK1表达低于MTX组(P<0.05)，但云克组间差异无统计学意义(P>0.05)；云克干预组和MTX组血清和关节液TNF-α水平、踝关节区滑膜及软骨TNF-α表达组间差异无统计学意义(P>0.05)；相关性分析显示模型组及药物干预组大鼠血清和关节液DKK1与TNF-α水平呈正相关(r=0.439，P<0.05)。结论:云克可以减轻CIA大鼠骨侵蚀，疗效优于MTX，可能是通过直接降低DKK1或通过抑制TNF-α间接下调DKK1，增强Wnt信号通路保护骨侵蚀。

胶原诱导性关节炎； 骨侵蚀； DKK1； 肿瘤坏死因子-α；99锝-亚甲基二磷酸盐

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性疾病，以滑膜炎症及骨侵蚀为特征。进展性的骨侵蚀是RA区别于其他关节炎最主要的特征，发生较早，致残率高，并缺乏伴随的新骨形成[1]。最新研究发现成骨细胞增殖活化主要由Wnt信号通路调节，包括骨形成和骨重塑，dickkopf-1(DKKl)作为Wnt信号通路的抑制剂被认为是骨侵蚀的关键因素[2]。另有研究[3-4]表明肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以增加DKK1表达，且TNF-α是RA炎症因子网络中主要的炎症因子，从而使骨形成进一步减少，骨破坏增多。99锝-亚甲基二磷酸盐(99Tc-MDP，商品名：云克)是我国自主研发的新型的抗风湿药，目前临床用于治疗RA效果显著，尤其是在保护骨侵蚀方面[5]，作用机制尚不完全明确，甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)为传统DMARDs类药物，是经典的治疗RA药物及联合用药的基础药。本研究采用胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型观察CIA大鼠DKK1的表达，及不同剂量云克治疗CIA大鼠骨侵蚀的作用，并探讨云克治疗骨侵蚀的可能作用机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠55只，体重160～180g，东南大学医学院动物实验中心提供并饲养，合格证号为SYXK(苏)2010-0004。

1.2 试剂及仪器

鸡Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂(Sigma公司)，99Tc-MDP(成都云克药业有限责任公司)，MTX注射液(上海华联制药厂)，大鼠TNF-α、DKK1酶联免疫检测试剂盒(ADL公司)，兔抗大鼠TNF-α一抗(NOVUS生物公司)，兔抗大鼠DKK1一抗(Santa Cruz公司)，免疫组化SP试剂盒、羊抗兔二抗和二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；切片机(德国LEICA公司)、光学显微镜(日本Olympus公司)、X线摄片机(德国GE公司)、酶标仪(美国Biorad公司)。

1.3 实验方法

1.3.1CIA大鼠模型建立 健康雄性SD大鼠伺养1周后随机选取8只作为空白组，其余用于造模。将鸡Ⅱ型胶原30mg溶于0.1mol·L-1醋酸15ml中，4℃过夜后与15ml完全弗氏佐剂充分乳化，制成1g·L-1胶原乳剂。随后于大鼠尾背部及根部多点皮下注射，每只0.5ml，1周后再次皮下等量注射。空白组皮下注射等量体积的生理盐水。

1.3.2分组与处理 初次免疫后28d对大鼠四肢关节炎进行评分，关节炎指数(arthritis index，AI)评分标准为：0分，无红肿；1分，足趾关节红肿；2分，趾关节、足趾部均红肿；3分，踝关节以下均红肿；4分，包括踝关节全部红肿。选取评分≥6分大鼠随机分为模型组、MTX组、云克小剂量组、云克大剂量组，每组8只。MTX组：尾静脉注射MTX2.0mg·kg-1·周-1；云克小剂量组：尾静脉注射云克2.0mg·kg-1·d-1；云克大剂量组：尾静脉注射云克4.0mg·kg-1·d-1；空白组和模型组：每天尾静脉注射与云克大剂量组等体积的生理盐水。各组持续注射3周。MTX剂量和云克小剂量根据人和大鼠的剂量转换[公式：B种动物的剂量(mg·kg-1)=W×A种动物的剂量(mg·kg-1)，W为折算系数]，剂量相当于人体用量的10倍。初次免疫28d后每周行眶周取血2ml，离心后取上清液于-80℃保存。

1.3.3标本留取 给药结束后处死所有大鼠，用1ml生理盐水冲洗膝关节腔留取膝关节液，-80℃保存，取右后踝关节置于10%中性福尔马林溶液固定，EDTA溶液脱钙后石蜡包埋，常温保存。

1.3.4X线评分 给药结束后，所有大鼠在水合氯醛麻醉下对右后踝关节进行X线摄片(电压40kV，电流7mA，曝光时间0.04ms)。踝关节骨质破坏程度评分采用Larsen评分标准：0分为正常；1分为轻度异常，包括1处或多处关节周围软组织肿胀，骨质疏松和轻微关节间隙狭窄；2分有明显早期异常，包括明显骨质侵蚀改变，有或没有关节间隙狭窄；3分为中度关节破坏；4分为重度关节破坏；5分显示多个异常，关节间隙消失。

1.3.5病理组织形态学观察 包埋好的右踝关节石蜡标本切片、脱水、苏木素-伊红(HE)染色，观察并摄片，根据踝关节病理组织形态学，按0～3分标准分别对滑膜炎细胞浸润、软骨及骨破坏情况进行评分，评价右踝关节滑膜炎及骨质破坏程度。

1.3.6ELISA法检测血清及关节液TNF-α和DKK1水平 将-80℃保存的血清及关节液标本室温中复融混匀后5000r·min-1离心5min，取上清液按试剂说明书进行试验，酶标仪波长设定为450nm，以标准品的OD值为横坐标、浓度为纵坐标做出线性曲线方程，从而将样品的OD值换算成对应的浓度。

1.3.7免疫组化法检测踝关节区滑膜及软骨的TNF-α和DKK1表达 右后踝关节石蜡标本切片、脱蜡、微波修复抗原，H2O2酶内源性阻断，动物血清封闭，滴加TNF-α和DKK1一抗4℃过夜后加入二抗、SP溶液，经DAB显色、苏木精复染、分化、脱水、透明和封片后观察并摄片，采用图像分析系统Image-Pro Plus 6.0对组织中滑膜及软骨区域的TNF-α和DKK1表达进行半定量分析，每张切片随机选取10个视野，并以10个视野的平均光密度值代表TNF-α和DKK1表达量。

1.4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差表示，若满足正态性和方差齐性，组间检验采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义；相关性分析采用Spearman检验。

2 结 果

2.1 一般情况观察

正常大鼠造模前饮食正常、活动自如、体重增长速度正常、毛发有光泽、反应灵敏，造模后出现不同程度的摄食及活动减少、毛发枯燥及体重减轻、反应迟钝，初次免疫14d后相继出现关节红肿、皮肤紧绷、活动受限，以双后足受累为主，逐渐加重，部分出现关节功能障碍，药物治疗后关节肿胀、活动受限均有所减轻，摄食及活动好转，空白组无上述异常改变。

2.2 AI评分

初次免疫28d后对造模大鼠进行AI评分，药物干预前模型、MTX、云克小剂量及云克大剂量组AI值差异无统计学意义(P>0.05)，药物干预后1周(35 d)云克大小剂量组AI值显著低于模型组及MTX组(P<0.05)，云克大小剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)，药物干预后3周(49 d)MTX组AI值显著低于模型组(P<0.05)，见表1。

a与模型组比较，P<0.05； b与MTX组比较，P<0.05

2.3 X线评分

空白组大鼠关节间隙清晰，骨关节面完整，骨密度均匀，无关节骨质破坏。与空白组相比，模型组及药物干预组均有不同程度的骨质破坏，其中模型组大鼠骨质破坏明显，部分大鼠关节间隙狭窄甚至消失。MTX组Larsen评分低于模型组(P<0.05)。云克大小剂量组Larsen评分均低于模型组及MTX组(P<0.05)，云克大小剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

a.正常组； b.模型组； c.MTX组； d.云克小剂量组； e.云克大剂量组

图1 各组大鼠右后踝关节X线表现

Fig 1 The right hind ankle X-ray appearances of all groups rats

2.4 病理组织形态学观察

空白组踝关节面完整，滑膜细胞无增生，软骨细胞排列整齐，骨组织无破坏。模型组踝关节区滑膜细胞有中至重度的增生、变性或坏死，滑膜组织内有中度以上的纤维组织增生和炎细胞浸润，踝关节骨和软骨受到明显破坏，甚至部分关节腔消失。药物干预组较模型组病理组织形态学评分均有不同程度减低(P<0.05)，且云克大小剂量组滑膜炎、骨和软骨破坏均较MTX组轻(P<0.05)，云克大小剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

a.空白组; b.模型组; c.MTX组； d.云克小剂量组; e.云克大剂量组

图2 各组大鼠右后踝关节病理学表现 HE×100

Fig 2 Pathological results of the right hind ankle joints in different groups(HE ×100)

2.5 ELISA法检测血清及关节液TNF-α和DKK1水平

2.5.1血清及关节液中DKK1水平 初次免疫28d(给药前)CIA大鼠血清和关节液DKK1的水平均较空白组显著增加(P<0.05)，MTX组血清DKK1水平于给药2周后显著低于模型组(P<0.05)，云克大小剂量组血清DKK1水平于给药1周后显著低于模型组及MTX组(P<0.05)，云克干预组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。MTX组关节液DKK1水平低于模型组(P<0.05)，云克大小剂量组关节液DKK1水平显著低于模型组和MTX组(P<0.05)，云克大小剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.5.2血清及关节液中TNF-α水平 初次给药28d(给药前)CIA大鼠血清和关节液TNF-α水平均较空白组显著增加(P<0.05)，药物干预组血清TNF-α水平给药1周后均明显低于模型组(P<0.05)，且各药物干预组组间差异无统计学意义(P>0.05)。药物干预组关节液TNF-α水平明显低于模型组(P<0.05)，且药物组组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

a 与正常组比较，P<0.05； b 与模型组比较，P<0.05； c 与MTX组比较，P<0.05

a 与正常组比较，P<0.05； b 与模型组比较，P<0.05

2.5.3模型组及药物干预组血清及关节液DKK1水平与TNF-α水平的相关性分析 模型、MTX、云克小剂量及云克大剂量组血清和关节液DKK1水平与TNF-α水平呈正相关(r=0.439，P<0.05)。见图3。

2.6 免疫组化法检测踝关节区TNF-α和DKK1表达

免疫组化显示阳性表达区域呈棕黄色，TNF-α和DKK1阳性表达主要定位于滑膜细胞及软骨细胞胞浆。空白组中踝关节区滑膜及软骨仅见少量阳性表达，模型组阳性表达明显增多，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件行半定量分析，比较各组平均光密度(mean optical density，MOD)显示，与模型组相比，药物干预组踝关节区滑膜及软骨DKK1、TNF-α表达均显著降低(P<0.05)，云克大小剂量组踝关节区滑膜及软骨DKK1表达低于MTX组(P<0.05)，云克大小剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)；云克大小剂量组、MTX组踝关节区滑膜及软骨TNF-α表达组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4，图4、5。

图3 DKK1和TNF-α的相关性分析

Fig 3 The correlation analysis of synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αin model and drugs intervention groups

a 与正常组比较，P<0.05； b 与模型组比较，P<0.05； c 与MTX组比较，P<0.05

3 讨 论

RA本身不仅可以引起局部的骨侵蚀，还可以导致全身性的骨质丢失，为骨质疏松性骨折显著性的独立危险因素。骨侵蚀的发生一方面是因为破骨细胞过度增殖活化，另一方面，越来越多的研究[6]发现RA的骨形成存在缺陷，即破骨细胞增殖活化能力增强，但成骨细胞并没有相应活化增多，从而造成骨质减少，导致骨侵蚀。

DKK1是一种定位于胞浆的Wnt经典信号通路的抑制剂，通过与共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein-5，LRP5)结合抑制经典Wnt信号通路。Wnt信号通路是调节骨形成的重要信号通路，并由经典Wnt/β-catenin发挥主要作用，Wnt蛋白激活经典Wnt信号通路后，通过胞内

a.空白组； b.模型组； c.MTX组； d.云克小剂量组; e.云克大剂量组

图4 DKK1在踝关节区滑膜及软骨的表达 免疫组化×200

Fig 4 Expression of DKK1 in synovial membrane and cartilage of ankle joints(immunohistostaining ×200)

a.空白组； b.模型组； c.MTX组； d.云克小剂量组; e.云克大剂量组

图5 TNF-α在踝关节区滑膜及软骨的表达 免疫组化×200

Fig 5 Expression of TNF-αin synovial membrane and cartilage of ankle joints(immunohistostaining ×200)

信号传导活化核内转录因子，通过促进干细胞更新刺激成骨前体细胞增殖，诱导成骨细胞分化，抑制成骨细胞及骨细胞凋亡等机制增加骨量。研究[7]表明，经典Wnt/β-catenin通路参与了RA的发病。LRP5失去功能的突变将导致骨密度降低、骨脆性增加[8]，LRP5表达增加将导致骨量增多[9]。另有研究[10]显示经典Wnt信号可以激活骨形态生成蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP2)在成骨细胞的表达，其中BMP2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。经典Wnt通路不仅影响骨形成过程，还通过上调骨保护素(osteoprotegerin，OPG)表达水平及下调核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)表达水平抑制骨吸收[11-12]。DKK1通过抑制经典Wnt信号通路，使其促进成骨细胞增殖活化的功能受阻，并通过抑制Wnt信号通路阻碍其激活BMP2的功能，同时下调OPG的表达，增加RANKL表达，促进破骨细胞活化，增加骨侵蚀。研究[13]发现，RA患者血清中DKK1表达水平明显高于正常组及原发性骨质疏松病人。

TNF-α是RA发病机制中具有重要地位的促炎症细胞因子，可以刺激RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)表达增加，促进破骨细胞生成，或直接通过TNF受体1诱导破骨细胞前体细胞，促进破骨细胞增加，导致骨侵蚀[1]。研究[4]发现TNF-α可通过TNF受体1和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)直接诱导DKK1表达，或通过刺激11β-羟基类固醇脱氢酶1型(11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，11β-HSD1)表达间接诱导DKK1表达[3]，从而使骨形成减少，骨破坏增多。

云克是元素锝[99Tc]经氯化亚锡还原后与亚甲基二膦酸(MDP)形成的螯合物。99Tc在人体内通过得失电子而不断清除体内的自由基，抑制炎症因子，MDP属于双膦酸盐，有很强的抗骨吸收能力，可以抑制骨髓干细胞分化为破骨细胞，并吸附于羟基磷灰石晶体表面，阻碍破骨细胞和骨矿化物的接触，99Tc和MDP螯合后具有消炎止痛、抑制病理复合物、抑制TNF-α等炎症因子骨质破坏、延缓和修复骨侵蚀等作用[5]。研究[14-16]证实云克可抑制TNF-α、 白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-17等炎症因子的产生。亦有研究[17]显示云克具有保护骨侵蚀功能。MTX作为改善病情抗风湿的代表药，主要是通过抑制TNFα、IL-17、IL-6等细胞因子而抑制炎症反应，从而达到治疗RA、抑制骨破坏的目的[18]。

本研究采用CIA大鼠构建RA动物模型，研究[19]表明CIA大鼠模型的症状、病理学改变与RA类似，且都有针对CIA的自身免疫，受主要组织相容性复合体及相关基因控制，有热休克蛋白的变性，是研究RA理想的动物模型。本试验成功构建CIA模型，造模大鼠相继出现关节红肿，活动受限，部分大鼠出现关节功能障碍，AI评分显示造模成功。X线摄片示模型组大鼠骨质破坏明显，部分出现关节间隙狭窄甚至消失，病理组织形态学观察发现模型组踝关节区骨和软骨受到明显破坏，部分关节腔消失，而药物干预组上述骨质破坏明显减轻，云克大小剂量组骨质破坏均较MTX组轻，云克大小剂量组疗效差异无统计学意义，说明云克对CIA大鼠骨侵蚀有明确的保护作用，且优于MTX，云克剂量大小对保护骨侵蚀功能无明显影响。本实验发现云克治疗组血清及关节液中DKK1水平和踝关节区DKK1蛋白表达较模型组及MTX组均显著性降低，差异有统计学意义，云克治疗骨侵蚀的机制之一可能是通过抑制DKK1的表达，从而增强Wnt通路作用于成骨细胞的作用，且疗效优于MTX，云克大小剂量治疗组组间差异无统计学意义，提示云克剂量大小对治疗骨侵蚀的疗效无明显影响，但因为本实验采用2.0mg·kg-1·d-1小剂量，剂量进一步降低对疗效是否有影响没有进行验证，因而此结论具有一定的局限性。另外，与模型组相比，云克治疗组可以显著降低血清及关节液中TNF-α水平和踝关节区TNF-α蛋白表达，DKK1水平与TNF-α呈正相关，云克通过抑制TNF-α间接降低DKK1，增强Wnt信号通路，增加成骨合成，减少破骨生成，从而保护骨侵蚀。

综上所述，云克可以减轻CIA大鼠骨侵蚀，疗效优于MTX，可能是通过直接降低DKK1或通过抑制TNF-α间接降低DKK1，增强Wnt信号通路，增加成骨合成，减少破骨生成，从而保护骨侵蚀的。

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Expression of DKK1 in collagen-induced arthritis rats and the intervention of99Tc-MDP

GU Zhi-qin1，WANG Mei-mei2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofRheumatology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To observe the expression of dickkopf-1(DKKl) and the effects of99Tc-MDP on bone erosion in collagen-induced arthritis(CIA) rats， and to explore the possible treatment mechanism of99Tc-MDP. Methods: The CIA models were established by subcutaneous injection with typeⅡ collagen and complete Freud’s adjuvant to rats. CIA rats were randomly divided into 4 groups: model group， methotrexate(MTX) group， low dose99Tc-MDP group， and high dose99Tc-MDP group. Destruction of bone were assessed by Larsen score and histopathological score. The synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αwere tested by ELISA. The synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 and TNF-αwere tested by immunohistochemistry.Ttest， analysis of variance， and correlation analysis were used for statistic analysis. Results: Compared with model group， destruction of bone， synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-α， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 and TNF-αin drugs intervention groups were significantly decreased(P<0.05). Destruction of bone， synovial fluid and serum levels of DKK1， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 in99Tc-MDP intervention groups were notably lower than those in MTX group(P<0.05)， and the indexes in both99Tc-MDP groups illustrated no significant difference(P>0.05). Moreover， synovial fluid and serum levels of TNF-α， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of TNF-αin MTX group and both99Tc-MDP groups demonstrated no significant differences(P>0.05). Correlation analysis showed that synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αin model and drugs intervention groups were positively correlated(r=0.439，P<0.05). Conclusion:99Tc-MDP can reduce bone erosion of CIA rats， and the therapeutic effect is better than MTX， probably by reducing the DKK1 directly or inhibiting DKK1 to lower down TNF-αindirectly， thereby enhancing the wnt signaling pathway to protect bone erosion．

collagen-induced arthritis； bone erosion； dickkopf-1； tumor necrosis factor-α；99Tc-MDP

2015-01-30

2015-03-20

江苏省自然科学基金资助项目(BK2009276)

顾志琴(1988-)，女，江苏泰州人，在读硕士研究生。E-mail：guzhiqin1030@163.com

王美美 E-mail：wmm3272142@163.com

顾志琴,王美美.99Tc-MDP抑制胶原诱导性关节炎大鼠DKK1表达的研究[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):514-521.

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．005

R-332； R593.21; R593.22

A

1671-6264(2015)04-0514-08