人参、西洋参不同部位中齐墩果酸型皂苷含量的对比分析

王佳，郑培和，许世泉，刘敏，王英平※

(1．吉林农业大学中药材学院，长春 130118； 2．中国农业科学院特产研究所，长春 130112；3．吉林省标准研究院，长春 130022)

人参(PanaxginsengC.A.Mey.)和西洋参(PanaxquinquefoliumL.)同属于五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，根部入药，是2种名贵的中药材，已被广泛应用。经研究发现，两者中均含有三萜类皂苷成分，同时也是两者药理活性的主要活性物质[1]。齐墩果酸型皂苷作为人参皂苷中的一类重要组成成分，具有抗肿瘤、降血糖、保肝、抗菌以及提高免疫等药理活性[2～6]。本试验通过对人参和西洋参不同部位中齐墩果酸型皂苷的鉴定以及人参皂苷Ro的含量测定，观察齐墩果酸型皂苷在二者不同组织中的分布状况，为人参和西洋参中齐墩果酸型皂苷的研究及开发提供参考。

1 仪器与材料

1200-6310高效液相色谱质谱联用仪、DAD检测器(Agilent公司)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HC-2514高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

对照品人参皂苷Ro、竹节参皂苷Iva、姜状三七皂苷R1(成都植标化纯生物技术有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)；乙酸铵、氨水(色谱纯，Sigma公司)；其它试剂均为分析纯。

人参(吉林省集安市板岔村，6年生)、西洋参(吉林省抚松县，4年生)，经许世泉副研究员鉴定分别为五加科人参属人参和西洋参。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent TC-C18(4.6mm×250mm，5μm)。流动相：2.5mmol/L乙酸铵(w/v)和0.05‰氨水(v/v)水溶液(A)-乙腈(C)。梯度洗脱：0min～4min，17.5% C；4min～9min，17.5%～28.9% C；9min～19min，28.9%～40% C；19min～24min，40% C；24min～34min，40%～53.3% C；34min～44min，53.3%～56.6% C；44min～54min，56.6%～95% C；30min～35min，95% C。流速：1mL/min。柱温：35℃。检测波长：203nm。进样体积：10μL。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式；干燥气流速：8L/min；雾化气温度：350℃；气帘气：35psi；化合物稳定性：100%；离子阱目标离子：m/z 900；扫描范围：m/z 150～1500；离子阱累积目标离子：30 000；采集时间：50ms；自动二级质谱；自动优化碰撞能量范围：1.0V的30%～200%；碰撞时间：20ms。

2.3 样品制备及检测

2.3.1对照品溶液制备精密称取人参皂苷Ro对照品10.43mg，置于10mL容量瓶中，加适量甲醇，超声溶解后定容至刻度，配制成1mg/mL的对照品原液。另取对照品人参皂苷Ro、竹节参皂苷Iva、姜状三七皂苷R1适量，甲醇溶解，配制成混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液制备人参和西洋参4株，去泥土后分成根、茎、叶3部分，经50℃鼓风干燥后粉碎。各取样品细粉0.5g，置于50mL容量瓶中，甲醇定容至50mL，浸泡过夜。次日超声处理30min，放置室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取1mL置于1.5mL离心管内，4000r/min，离心10min，上清液0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

3 结果

3.1 齐墩果酸型皂苷鉴定

3.1.1对照品质谱分析取适量对照品混合液，在“2.1”和“2.2”项下进行质谱分析。其中，峰1为人参皂苷Ro(tR=17.6min)，峰2为竹节参皂苷Iva(tR=19.5min)，峰3为姜状三七皂苷R1(tR=23.7min)(图1A)。为进一步研究齐墩果酸型皂苷在负离子模式下的裂解行为，以人参皂苷Ro为例对其质谱裂解进行分析，并阐述该类型三萜皂苷化合物的裂解规律。

3.1.2人参皂苷Ro的MS/MS分析人参皂苷Ro在负离子模式下的母离子峰m/z 955[M-H]-。对分子离子峰进行MS裂解分析，其中，丰度最高的碎片离子m/z 793对应[M-H-Glc]-，m/z 613对应[M-H-2Glc-H2O]-，m/z 455对应[M-H-2Glc-GlcA]-，即脱去取代基上全部糖苷，为齐墩果酸。此外，还得到丰度较弱的碎片离子m/z 835、m/z 731、m/z 523，分别对应[M-H-120]-、[M-H-Glc-62]-、[M-H-2Glc-108]-，这与孟青等研究结果一致[7]。通过对人参皂苷Ro质谱裂解规律进行分析，齐墩果酸型皂苷在负离子模式下较容易获得母离子[M-H]-。根据结构分析，C-3和C-28分别连有羟基和羧基，该类化合的C-3和C-28的糖苷键容易首先发生裂解，产生子离子碎片，并最终获得稳定的苷元碎片离子，即齐墩果酸。因此，将m/z 455作为该类化合物的特征碎片离子(图1B)。

3.1.3化合物1、化合物2、化合物3的鉴定负离子模式下，通过对化合物1、化合物2和化合物3质谱裂解规律进行分析，同时参考对照品的保留时间，得出3种化合物分别为人参皂苷Ro(1)、竹节参皂苷Iva(2)和姜状三七皂苷R1(3)。

3.1.4化合物4、化合物5的鉴定化合物4的保留时间为17.3min，负离子模式下的母离子m/z 1087，判断其分子量为1088；对子离子碎片进行分析，m/z 955、m/z 925、m/z 745和m/z 569 ，分别对应[M-H-Ara]-、[M-H-Glc]-、[M-H-2Glc-H2O]-、[M-H-2Glc-Ara-H2O-CO2]-。且齐墩果酸特征碎片离子m/z 455对应[M-H-GlcA-2Glc-Ara]-。由此推断化合物4是C-3和C-28位连有2个六碳糖、1个六碳糖酸和1个五碳糖的齐墩果酸型皂苷。根据文献，推断化合物4为Stipulenaoside R2[8](图1C)。

化合物5的保留时间为17.9min，负离子模式下的母离子峰m/z 1087[M-H]-，判断其分子量为1088；对其子离子碎片进行分析，m/z 955对应[M-H-Ara]-、m/z 925对应[M-H-Glc]-、m/z 731对应[M-H-Glc-Ara-62]-，且碎片离子中含有m/z 455齐墩果酸苷元特征碎片。化合物5与化合物4相比较分子量相同，由于糖基团的连接位置不同导致子离子碎片及丰度有所差异，根据保留时间不同，判断化合物4和化合物5为同分异构体。根据文献报道，推断该化合物为Armatoside[9](图1D)。

3.1.5化合物6的鉴定化合物6的保留时间为15.2min，负离子模式下的母离子m/z 1117，判断其分子量为1118；对其子离子碎片进行分析，m/z 793对应[M-H-2Glc]-、m/z 731对应[M-H-2Glc-62]-、m/z 613对应[M-H-3Glc-H2O]-、m/z 570对应[M-H-3Glc-H2O-CO2]-、m/z 453对应[M-H-3Glc-GlcA-H2]-，推断此化合物为Elatoside K[10](图1E)。

A.对照品溶液的总离子流图，B.人参皂苷Ro的MS/MS图谱；C.化合物4的MS/MS图谱；D.化合物5的MS/MS图谱；E.化合物6的MS/MS图谱

3.1.6人参和西洋参不同部位齐墩果酸型皂苷的鉴定通过采用LC-MS/MS分析人参和西洋参不同部位的齐墩果酸型皂苷，共鉴定出人参皂苷Ro(1)、竹节参皂苷Iva(2)、姜状三七皂苷R1(3)、Stipulenaoside R2(4)、Arrnatoslde(5)和Elatoside K(6)6种齐墩果酸型皂苷，其结构如图2和表1。其中，人参中共发现3种齐墩果酸型皂苷，分别为化合物1、化合物2和化合物3，且根、茎、叶中均含有该3种化合物(图3)；西洋参共检测出6种齐墩果酸型皂苷，但不同部位中所含化合物种类却各不相同。根部为该类型皂苷种类分布最多的部位，共6种，而茎、叶相比于根则皂苷种类较少，其中，茎中发现化合物1、化合物3和化合物4，叶中则仅发现化合物1和化合物4(图4)。人参和西洋参不同部位中齐墩果酸型皂苷分布状况见表2。

图2 齐墩果酸皂苷元结构

表1齐墩果酸型皂苷结构

Table1Thestructureofoleanolicacidtypesaponins

化合物 CompoundR1R2人参皂苷RoGingsenosideRo-GlcA2-Glc-Glc竹节参皂苷IvaChikusetsusaponinIva-GlcA-Glc姜状三七皂苷R1ZingibrosideR1-GlcA2-Glc-HStipulenaosideR2-GlcA3-Glc-Glc | Ara4(f)Armatoside-GlcA2-Glc2-Ara-GlcElatosideK-GlcA2-Glc-Glc | Glc3

3.2 方法学考察

3.2.1线性关系考察从对照品原液中分别取不同体积溶液置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成7个不同浓度的对照品溶液，进样体积10μL，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品溶液的质量浓度X(μg/mL)对峰面积Y进行线性回归，得人参皂苷Ro线性方程Y=2.1437x-0.7291，相关系数r=0.9999，0.52μg/mL～62.58μg/mL具有良好的线性范围。

A.人参根总离子流图；B.人参根中化合物2和化合物3的提取离子流图；C.人参茎中化合物2和化合物3的提取离子流图；D.人参叶中化合物2和化合物3的提取离子流图A.TIC of ginseng root;B.Extracted ion chromatogram(EIC) of compound 2 and 3 in ginseng root;C.EIC of compound 2 and 3 in ginseng stem;D.EIC of compound 2 and 3 in ginseng leaf

A.西洋参根总离子流图；B.西洋参根中化合物6的提取离子流图；C.西洋参根中化合物4和化合物5的提取离子流图；D.西洋参茎总离子流图；E.西洋参叶总离子流图

表2人参和西洋参不同部位中齐墩果酸型皂苷分布状况

Table2ThedistributioncharacteristicsofoleanolicacidtypesaponinsindifferentpartsofginsengandAmericanginseng

化合物Compound人参根Ginsengroot人参茎Ginsengstem人参叶Ginsengleaf西洋参根Americanginsengroot西洋参茎Americanginsengstem西洋参叶Americanginsengleaf人参皂苷RoGinsenosideRo○○○○○○竹节参皂苷IvaChikusetsusaponinIva○○○○××姜状三七皂苷R1ZingibrosideR1○○○○○×StipulenaosideR2×××○○○Armatoside×××○××ElatosideK×××○××

注：○.发现；×.未发现。

Note：○.Found；×.No found.

3.2.2精密度实验取同一浓度对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样3次，进样体积10μL。测定对照品的色谱峰面积并进行积分，经计算RSD为0.51%，表明仪器精密度良好。

3.2.3重复性实验取同一批供试品，精密称取0.5g，按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件检测，进样体积10μL。测定人参皂苷Ro的色谱峰面积并进行积分，经计算RSD为1.95%，表明该方法重复性良好。

3.2.4稳定性实验取同一供试品溶液，分别于制备后0h、4h、8h、12h、24h检测，进样体积10μL。测定人参皂苷Ro的色谱峰面积并进行积分，经计算RSD为0.38%，表明该供试品溶液在24h内稳定性良好。

3.2.5加样回收率实验精密称取同一批已知含量西洋参供试品6份，每份0.5g，分别加入人参皂苷Ro对照品原液(1.043mg/mL)1mL，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱方法测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3加样回收率实验结果

Table 3 Results of recovery test

3.3 人参皂苷Ro含量分析

3.3.1人参各部位人参皂苷Ro含量分析人参中人参皂苷Ro主要积累于根部，平均含量为0.214%，约占根、茎和叶中人参皂苷Ro总含量的75.09%。而茎和叶中该化合物的相对含量较低，平均含量分别为0.051%和0.020%，二者仅占总含量的24.91%。比较茎、叶中人参皂苷Ro的含量发现，茎中人参皂苷Ro含量占茎和叶总含量的71.83%，而叶中人参皂苷Ro含量仅为28.17%，茎中含量约为叶中含量的2.55倍。通过对根、茎和叶的人参皂苷Ro含量比较分析得出，人参各部位中人参皂苷Ro的含量比较顺序为根>茎>叶，相对应部位含量比例约为10.7∶2.6∶1(表4)。

表4人参不同部位中人参皂苷Ro含量

Table 4 Relative percentage of ginsenoside Ro in different parts of ginseng (%)

3.3.2西洋参各部位人参皂苷Ro含量分析西洋参中人参皂苷Ro也主要积累于根部，平均含量为0.576%，约为根、茎和叶中总含量的94.89%。茎和叶中该化合物相对含量极低，平均含量为0.022%和0.009%，且两者仅占总含量的5.11%。相比较茎、叶中含量的发现，茎中人参皂苷Ro含量占茎和叶总量的70.97%，而叶中则为29.03%。通过对西洋参根、茎和叶中人参皂苷Ro的含量比较分析后得出，各部位含量大小顺序为根>茎>叶，相对应部位含量比例约为64.0∶2.5∶1(表5)。

表5西洋参不同部位中人参皂苷Ro含量

Table 5 Relative percentage of ginsenoside Ro in different parts of American ginseng (%)

3.3.3人参和西洋参各部位人参皂苷Ro含量比较通过对人参、西洋参各部位含量的测定发现，人参皂苷Ro均主要分布于两者的根部，但西洋参明显高于人参，约为人参的2.69倍。二者茎和叶中的含量均较低，尤其是西洋参，但是比较茎、叶中的含量发现，人参茎叶含量却高于西洋参，约为西洋参的2.29倍。虽然在含量差异方面理论倍数与上述根部较为接近，但却与其它情况相反。通过对比人参和西洋参各部位中人参皂苷Ro含量比例得出，各自茎和叶中的含量比例基本接近，但二者总和占各自植株总量比例不同，以根部含量为最高。由此得出，二者根部均为人参皂苷Ro积累的主要部位，尤其以西洋参更为显著。

4 讨论

目前，对于人参和西洋参主要活性成分的研究主要以达玛烷型皂苷为主[11～13]，而齐墩果酸型皂苷的研究则相对较少[14]。本实验共发现6种齐墩果酸型皂苷，其中3种在西洋参中首次发现，西洋参中齐墩果酸型皂苷的种类较人参中丰富。研究发现，人参皂苷Ro为人参和西洋参中含量最高的齐墩果酸型皂苷[15]，因此在含量分析方面具有研究代表性。

本研究发现，人参皂苷Ro在人参和西洋参中的含量顺序均为根>茎>叶，根部为其主要积累部位，而茎、叶中含量甚低。这与人参和西洋参叶中达玛烷型皂苷含量丰富可作为人参皂苷的来源有较大差异[13，16]。形成这一现象的原因可能由于人参皂苷Ro为齐墩果酸型五环三萜类皂苷，与达玛烷型四环三萜类皂苷在结构上有本质区别，在生物合成过程中，后者在含量和多样性上高于前者而导致两种类型皂苷成分在不同部位中含量分布有所差异[17]。

5 结论

本实验探讨了齐墩果酸型皂苷在人参和西洋参不同部位中种类及人参皂苷Ro含量的分布特征，结果表明，齐墩果酸型皂苷次生代谢产物的主要积累部位为根部，与达玛烷型皂苷次生代谢产物在茎、叶中的积累规律形成鲜明对比，从而完善了人参和西洋参中三萜类皂苷成分的分布特征。

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