羊耳菊药材中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定

田妍妍，周桂荣，霍志鹏，逄小倩，何 毅，李 萍

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.天士力制药集团股份有限公司研究院 现代中药研究所，天津 300410)

羊耳菊药材中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定

田妍妍1，2，周桂荣2，霍志鹏2，逄小倩2，何 毅2，李 萍1△

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.天士力制药集团股份有限公司研究院 现代中药研究所，天津 300410)

目的 建立羊耳菊药材中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的HPLC含量测定方法，为其质量控制和运用提供依据。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸水(17∶83)为流动相等度洗脱，检测波长329 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min。结果 测定了20批不同产地的羊耳菊药材，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量在0.12%～0.65%之间。结论 该方法简便、准确、重复性好，可用于羊耳菊药材的质量评价。

羊耳菊；3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸；高效液相色谱法；含量测定

羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.)DC为菊科Compositae旋覆花属InulaL植物，亚灌木，主要分布于我国四川、云南、贵州、广西、广东、江西、湖南、福建、浙江等地，全草或根可供药用，有除痰定喘、疏风散寒、解毒消肿、活血调经及治跌打损伤等作用[1]，可用于感冒发热，咽喉肿痛，风湿疼痛等[2]。

国内外报道分离的羊耳菊化学成分已有100余种，主要包括萜类、有机酸类、黄酮类、挥发油类等类型[3-6]。3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等诸多药理作用[7]，本研究采用HPLC法测定了羊耳菊药材中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，以期为羊耳菊药材的质量控制提供方法和依据。

1 材料

1.1 仪器 waters 2695系列高效液相色谱仪(美国Waters 公司)，Milli-Q型超纯水系列(美国Millipore 公司)，XS-205DU型1/10万分析天平(瑞士梅勒特-托利多公司)

1.2 试药 乙腈、甲醇(色谱纯，美国Merck公司)，乙醇(分析纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，水为自制超纯水。3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(批号111782-201204，纯度94.2%)购自中国食品药品检定研究院，20批羊耳菊药材于2013年-2015年采集于云南，广东，广西，贵州四省(表1)，并经中国药科大学李萍教授鉴定为植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.)DC的新鲜或干燥全草。

表1 羊耳菊药材产地、部位、采收时间明细

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈：0.1%磷酸水(17：83)，流速1 ml/min，检测波长329 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品11.78 mg置50 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.2219 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取羊耳菊粉末(过四号筛)约1.0 g，置60 mL索氏提取器中，加入120 mL甲醇，加热回流4 h，提取液浓缩至约10 mL，放冷，移入25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，5000 r/min，20 ℃下离心10 min，吸取上清液，即得。

2.3 系统适应性试验 按照2.1项下的色谱条件，吸取3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液，供试品溶液进样测定，色谱图见图1。理论板数按3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰计≥5000，供试品色谱图中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的保留时间与对照品相应的保留时间一致，与其他组分峰的分离度大于1.5。

A.对照品；B.供试品；1.3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸

2.4 线性关系考察 精密吸取2.2项下的对照品溶液0.5，1，2.5，5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，分别加入甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，将5个不同浓度级别的对照品按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制工作曲线。结果表明，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸进样量在0.1110 μg-2.219 μg与峰面积成良好的线性关系，回归方程为Y=3949931X-28863，R2=0.9999。

2.5 精密度试验 精密称取6号羊耳菊样品粉末约1.0 g，按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试品，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，得3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD值为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取6号羊耳菊样品粉末约1.0 g，按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试品，按2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD值为1.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 精密称取6号羊耳菊样品粉末6份，各约1.0 g，按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试品，按2.1项下色谱条件进样检测，测得6份平行样品中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD值为0.46%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收试验 精密称取6号羊耳菊样品粉末(重复性试验测得3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量为0.1661%)6份，各约0.5 g，分别加入2.2项下的对照品溶液4 mL，并按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试品，按2.1项下色谱条件进样检测，结果见表2。

表2 3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸加样回收率

2.9 样品测定 取各产地羊耳菊样品粉末，按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试品，按2.1项下色谱条件测定，用外标法计算不同产地羊耳菊样品中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的百分含量，测定结果见表3。

表3 不同产地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的百分含量

3 讨论

预实验分别考察了加热回流、超声提取、索氏提取三种提取方式，二纯水、甲醇、乙醇3种提取溶剂，2、3、4 h 3种提取时间的提取效率，结果表明以甲醇为提取溶剂，经索氏提取4 h后3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量最高。

预实验比较了甲醇-水，乙腈-水等流动相系统，从分离情况和出峰时间等综合分析，选择乙腈-0.1%磷酸溶液以17：83等度洗脱，分离度较好，峰形对称且保留时间适中。

通过紫外光谱扫描，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸甲醇溶液在329 nm处有最大吸收，因此选择329nm为检测波长。

本实验对不同产地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量进行比较，20批不同产地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量在0.12%～0.65%之间，这种含量差异可能与羊耳菊产地生态环境，采收时间等因素有关。如果要更加全面的考察不同产地羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，仍需要采集更多，更具代表性的样品进行深入研究。

本实验采用高效液相色谱法对羊耳菊中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸进行含量测定，具有快速，准确，灵敏度高的特点，为羊耳菊的深入研究与开发提供了参考，也为羊耳菊质量控制提供了理论依据。

[1]中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1979，75：271.

[2]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：176.

[3]胡琳，贺正山.羊耳菊化学成分和药理活性研究进展[J].中国现代应用药学，2012，29(10)：889-894.

[4]杨雁，王于方，赵雷，等.羊耳菊花的化学成分研究[J].中草药，2011，42(6)：1083-1086.

[5]谢红刚，张宏武，张江，等.羊耳菊的化学成分[J].中国天然药物，2007，5(3)：193-196.

[6]郭启雷，杨峻山.羊耳菊的化学成分研究(Ⅱ)[J].中药材，2007，30(1)：35-37.

[7]李祖晟，朱志安.二咖啡酰奎宁酸药理实验研究进展[J].医学综述，2004，10(4)：249-251.

田妍妍(1992-)，女，在读硕士研究生，研究方向：生药活性成分与质量评价，E-mail：TianYansq@163.com

△通信作者：李萍，Tel：025-85391244，E-mail：liping2004@126.com

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