结核分支杆菌复合群DNA 分型研究进展

程广宇，刘春法，崔永勇，周 洋，赵德明，周向梅

（中国农业大学动物医学院，北京100193）

结核病（Tuberculosis，TB）是人类最古老的疫病之一，至今已感染无数的人群并且仍对易感人群造成巨大的威胁。2014年世界卫生组织（WHO）的结核病报告，2013 年新感染人数约为900 万，造成的死亡人数约为150万［1］。人类对结核病的起源和传染特性在很长一段时间里无从知晓，直到19世纪末Koch R［2］证实其是一种细菌性疾病。结核病主要是由结核分支杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）中的细菌引起的，是一种在全球范围内具有重要影响的人兽共患病，由于这类细菌对人和动物具有潜在感染的威胁，人们对其研究也越来越广泛和深入。

自1882年首次分离出结核分支杆菌病原体以来，人们已经获得了大量MTBC 细菌的特性、毒力及其致病性的知识，并从MTBC 引起宿主的免疫反应以及免疫逃逸机制进行了大量研究。但是，人们能够得以深入阐明结核分支杆菌复合群的起源和菌群结构，还是得益于近年来的基因组学和分子生物学技术的飞速发展。目前，有关结核病病原体的基因组数据越来越多，有关结核病公共健康的问题日益严重和突出，这就要求我们利用现有的基因数据库，加深对MTBC的起源和系统进化的理解，为开发更有效疫苗并制定更好的防控计划奠定基础。本文对最新的MTBC 的基因组DNA 分型技术进行总结并提出展望，以期对这类人类历史上传播最广致死最多的细菌病原体进行深入的分析和掌握，进而为防控这类病原体提供依据。

1 结核分支杆菌复合群

根据MTBC 菌株的宿主倾向性和基因组多样性不同，目前结核分支杆菌复合群的成员主要包括以下菌种。

1.1 结核分支杆菌

结核分支杆菌（M.tuberculosis）是导致人类结核病的主要病原体，也是对人类影响最大的细菌性病原体之一。目前已有诸多M.tuberculosis 感染牛、山羊、家猪、猫、狗、鹿和动物园中的野生动物等的报道。在全球范围内，M.tuberculosis 被广泛认为是一种亟需关注的人畜共患病病原体。在很多国家，尤其在发展中国家饲养牛感染M.tuberculosis的诊断越来越多［3］。Ameni G 等［4］在2011年的调查中发现在埃塞俄比亚的放牧牛中M.tuberculosis的感染率约为27%。

1.2 牛分支杆菌

牛分支杆菌（M.bovis）是牛科动物结核病中最常见的病原体，1898年首次分离出M.bovis菌株以来。虽然研究人员一直认为它和M.tuberculosis存在表型差异，但直到1970年才被认定为新的菌种。M.bovis宿主范围广泛，目前已有感染北美野牛、羚羊、山羊、家猪、野猪、马、猫、够等诸多动物的报道。目前在结核病人的诊断中，已出现多例M.bovis和M.tuberculosis混合感染的病例。但临床医生通常不会考虑到这点，因为由M.bovis和M.tuberculosis引起的疾病在临床诊断，射线照相检测以及组织病理学检查都是无法分辨的［5］。M.bovis对国家间经济贸易和人类公共卫生是不容忽视的潜在威胁。

1.3 坎纳分支杆菌

坎纳分支杆菌（M.canettii）是一种较为古老的结核分支杆菌复合群祖先菌株，与MTBC中的其他菌种差异较大是因为基因组中有很强的水平基因转移，特征是菌落培养快速且菌落形态光滑有光泽。法国微生物学家Georges Canetti最早于1969年分离出该菌种并进行研究。虽然偶有M.canettii感染人类的报道出现，但未有人与之间传播的报道。目前M.canettii在自然界中的生存模式和宿主范围仍是未知的。Blouin Y 等［6］对吉布提临床病人分离株进行的研究表明，对该病原体及它的自然宿主范围的更多认识对于临床诊断是非常重要的。

1.4 非洲分支杆菌

1968年在塞内加尔首次发现的非洲型结核分支杆菌（M.africanum），主要流行于非洲西部，是感染非洲西部近一半结核病人的病原菌。M.africanum 的传播性和致病性要弱于M.tuberculosis［7］。在非洲以外地区，偶有人类感染该病原体的报道。虽然在猴子和奶牛中都曾分离出M.africanum 菌株，但由于发生率低且难以鉴定，M.africanum 在自然界中生存的宿主依然不清楚。

1.5 海豹分支杆菌

最早从海豹中分离出海豹分支杆菌（M.pinnipedii），它的自然界宿主是南半球的海洋哺乳动物，近年来在全球各地区的海洋馆中偶有M.pinnipedii感染海狗、海豚等海洋动物的事件。而海豹驯兽师确认感染M.pinnipedii的报道表明了M.pinnipedii菌株人兽共患的潜在威胁［8］。最新的研究表明M.pinnipedii可以感染在海岸放牧的牛群，但无牛只间传播的证据［9］。

1.6 Caprae分支杆菌

Caprae分支杆菌（M.caprae）在过去一直被认为是M.tuberculosis或M.bovis的亚群，而oxyR、pncA、katG、gyrA 和gyrβ基因的基因多样性使它成为MTBC中的独立菌种。在欧洲中西部的很多国家的家牛、家猪、野猪和骆驼等动物中都曾分离出该菌株。欧盟委员会在2013 年已经把M.caprae划为牛结核病的病原之一。而人类感染M.caprae的报道使众多研究者对它的重视日愈增加［10］。

1.7 田鼠分支杆菌

田鼠分支杆菌（M.microti）最早由田鼠中分离出来，也可感染猫、家猪、獾等哺乳动物。20世纪50年代，在英国人们曾用M.microti当做活疫苗来对牛群进行免疫。而近期的报道表明，M.microti可诱导实验小鼠产生有效免疫。在英国西南地区，M.microti在獾群中流行，这可能使獾群产生对M.bovis的有效免疫而使得M.bovis在獾群中极少发生，并且也可能是当地无M.bovis感染牛群的关键因素。在近期欧洲山猪的结核病调查中，M.microti感染比例呈上升趋势，可能使未来结核病的防控更加复杂［11］。

2 MTBC的DNA 指纹图谱研究

MTBC中的菌株在16SrRNA 有一致的序列片段，在核苷酸水平约有99.9%的相似度，在很长一段时期被认为在自然界中是以单型菌株存在的［14］。后来发现的一些分子标志物，可以用于区分MTBC菌株。目前已经有一系列DNA 指纹图谱技术被广泛应用于MTBC流行病学和系统进化研究。

2.1 IS6110 限制性片段长度多态性分析

IS6110 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分 析 是MTBC第一个金标准分型方法。IS6110RFLP 分析基于Southern 印迹杂交技术，根据基因组中IS6110插入序列插入位点可变性和插入数目不同进行基因分型。优点是当IS6110插入序列重复数目超过6个，分辨力很强，可通过鉴别临床分离株是否具备一致的RFLP 型而应用于流行病学调查。缺点是由于无法推测插入事件的发生顺序因而不适合应用于系统进化研究，另一方面需要用到大量的DNA 样本，操作繁琐费时，不同实验室之间的结果难以比较［15］。目前使用该技术的研究呈现逐渐减少的趋势，同时基于PCR 技术的研究方法逐渐发展，得到更广泛的应用。

2.2 Spoligotyping 分 型

Spoligotyping分型方法基于PCR 反向点核酸杂交技术，根据直接重复区（DR 区）多样性对MTBC进行基因分型。DR 区内若干个长度为36bp的直接重复序列被不同长度的间隔区序列分隔，以选取的43个间隔区序列的存在或缺失记录结果。间隔区发生缺失原因可能是同源重组或者IS6110插入序列转座［16］。Spoligotyping分型优点是检测结果易于统计，便于实验室间交流比较，是目前广泛应用的MTBC基因分型方法。缺点是虽然间隔区缺失是不可逆事件，但是由于存在趋同进化现象，并不适合系统进化研究。Spoligotyping 分型与基因芯片、微球液相芯片等技术的结合应用使得数据处理可自动化，检测操作更加快速简便［17］。

2.3 多位点可变数目串联重复序列分析

多位点可变数目串联重复序列分析（multi－locus variable－number tandem repeat analysis，MLVA）是基于PCR 技术的基因分型方法。结核分支杆菌散在分布数目可变串联重复序列分型方法（mycobacterial interspersed repetitive units－variable number tandem repeats，MIRU－VNTR）通常根据选取的12、15或24位点序列重复数目多样性进行基因分型［18］。12或15位点的MIRU－VNTR 分型适合应用于流行病学研究，而24位点的MIRUVNTR 分型可用于MTBC 系统进化研究。目前诸多研究表明，根据地理位置不同和流行株的区别，可以选用合适的位点组合达到最佳的基因组分型效果［19－20］。

2.4 长序列多态性或区域缺失

由于MTBC菌株间几乎没有水平基因转移，长序列多态性（long sequence polymorphisms，LSP）或区域缺失（regions of deletions，RD）分析是MTBC系统进化研究和菌株间多样性研究的重要手段。基因组中一系列的插入或不可逆的缺失事件造成MTBC内各菌种之间的差异。研究表明所有的祖先菌株保存有TbD1序列，而现代菌株均表现为缺失。Gagneux S 等［21］运用比较基因组学的方法对MTBC内的菌株进行长片段多态性分析，鉴别出全球的六大主要的菌系（Indo－Oceanic；East－Asian including Beijing；East－African－Indian；Euro－American；West Africa or Mycobacterium africanumⅠ；West Africa or M.africanum Ⅱ）。RD 分析可用于MTBC内菌种的快速鉴定，例如RD9可将M.tuberculosis和M.canettii和MTBC 其他成员区分开，而RD4是M.bovis独有的缺失［22］。

2.5 全基因组测序

1999年MTBC 中的M.tuberculosis全基因组测 序（whole－genome sequencing，WGS）完 成 以来［23］，随着近5年DNA 测序技术的的快速发展，越来越多的MTBC临床株完成全基因组测序。WGS分型外的各种基因分型方法均有一定程度的缺陷，此外，多个调查研究表明这些研究手段均无法准确判断感染传播条链。因此，基于WGS 分析的基因分型方法无疑是MTBC 流行病学研究和系统进化研究最可靠的选择。目前多个研究小组运用比较基因组学分析，已提出不同的单核苷酸突变（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型体系。如Coll F等［14］提出62个SNPs分析方法对MTBC的6大主系和M.bovis以及55个亚系进行鉴别区分。Jamieson F B等［24］研究证明，全基因组分析的分辨力更高，准确性更高，尤其适用于基因组近似度更高的结核分支杆菌菌系。此外，对于拥有相同DNA指纹图谱的菌株，非同义氨基酸突变可能朝着有利于菌株的方向改变多肽链顺序，进而有助于理解抗药性突变菌株的发生和传播；而同义氨基酸突变不影响菌株功能性表达，可应用于MTBC系统进化研究，更好地理解菌株间的进化关系。

3 展望

Spoligotyping和MIRU－VNTR 分型方法的结合应用可大大提高基因分型的分辨力，适用于结核病分子流行病学调查研究［25－26］。目前已有多个基于全球不同地区Spoligotyping和MIRU－VNTR 分型基因分型数据的数据库，例如SITVITWEB 和MIRU－VNTRplus。目前美国CDC 结核病诊断标准要求对每一例结核病临床分离株进行Spoligotyping和MIRU 分型检测。

虽然结核分支杆菌复合群的基因组相似度极高，但是在进化过程中赋予了不同的宿主偏好、表型和致病性。近年来，尤其是比较基因组学理论和基因组测序技术的发展和普及应用，基于全基因组测序的结核分支杆菌复合群的数据日益增多。使用基因组比较工具等手段可以得到更可靠的全球MTBC基因组多样性分析结果，更好地应用于结核病分子流行病学调查研究和系统进化研究。还可以进一步研究基因组多样性对基因功能和宿主免疫识别等的影响，理解细菌病原体的毒力作用与宿主之间的互作关系，从而有助于了解结核病的发病机理并制定合理的防控措施。

Theobald Smith 1896年成功区分牛结核病和人类结核病的主要病原体分别是M.bovis和M.tuberculosis以来，结核分支杆菌复合群的成员不断壮大。但100多年以来，除了在结核病的预防治疗方面的具体研究和比较研究已取得一些进展，目前关于MTBC的进化途径、基因组差异和宿主倾向性等研究仍有很多疑问尚待解决，MTBC 的进一步研究依然有着巨大潜力。

［1］ WHO.Global tuberculosis report［R］.2014.

［2］ Koch R.Die aetiogie der tuberculose［J］.Berl Klin Wochenschr，1882，19：221－230.

［3］ Mittal M，Chakravarti S，Sharma V，et al.Evidence of presence of Mycobacterium tuberculosis in bovine tissue samples by multiplex PCR：possible relevance to reverse zoonosis［J］.Transb Emerg Dis，2014，61（2）：97－104.

［4］ Ameni G，Vordermeier M，Firdessa R，et al.Mycobacterium tuberculosis infection in grazing cattle in central Ethiopia［J］.Vet J，2011，188（3）：359－361.

［5］ Perez－Lago L，Navarro Y，Garcia－de－Viedm D.Current knowledge and pending challenges in zoonosis caused by Mycobacterium bovis：A review［J］.Res Vet Sci，2014，97：S94－S100.

［6］ Blouin Y，Cazajous G，Dehan C，et al.Progenitor“Mycobacterium canettii”clone responsible for lymph node tuberculosis epidemic，Djibouti［J］.Emerg Infect Dis，2014，20（1）：21－28.

［7］ Doughty E L，Sergeant M J，Adetifa I，et al.Culture－independent detection and characterisation of Mycobacterium tuberculosis and M.africanumin sputum samples using shotgun metagenomics on a benchtop sequencer［J］.Peer J，2014，2：e585.

［8］ Kiers A，Klarenbeek A，Mendelts B，et al.Transmission of Mycobacterium pinnipedii to humans in a zoo with marine mammals［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2008，12（12）：1469－1473.

［9］ Loeffler S H，de Lisle G W，Neill M A，et al.The seal tuberculosis agent，Mycobacterium pinnipedii，infects domestic cattle in New Zealand：epidemiologic factors and DNA strain typing［J］.J Wildlife Dis，2014，50（2）：180－187.

［10］ Lahlou O，Millet J，Chaoui I，et al.The genotypic population structure of Mycobacterium tuberculosis complex from moroccan patients reveals a predominance of Euro－American lineages［J］.PLoS One，2012，7（10）：e47113.

［11］ Chiari M，Ferrari N，Giardiello D，et al.Spatiotemporal and ecological patterns of Mycobacterium microti infection in wild boar（Sus scrofa）［J］.Transb Emerg Dis，2015.

［12］ Karpathy S E，Dasch G A，Eremeeva M E.Molecular typing of isolates of Rickettsia rickettsii by use of DNA sequencing of variable intergenic regions［J］.J Clin Microbiol，2007，45（8）：2545－2553.

［13］ Liang J，Teng X，Yuan X，et al.Enhanced and durable protective immune responses induced by a cocktail of recombinant BCG strains expressing antigens of multistage of Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Immunol，2015，66（2）：392－401.

［14］ Coll F，McNerney R，Guerra－Assuncao J A，et al.A robust SNP barcode for typing Mycobacterium tuberculosis complex strains［J］.Nat Commun，2014，5：4812－4816.

［15］ Nghiem M N，Nguyen B V，Nguyen S T，et al.A Simple，single triplex PCR of IS6110，IS1081，and 23Sribosomal DNA targets，developed for rapid detection and discrimination of Mycobacterium from clinical samples［J］.J Microbiol Biotechnol，2015，25（5）：745－752.

［16］ Garbaccio S，Macias A，Shimizu E，et al.Association between spoligotype－VNTR types and virulence of Mycobacterium bovis in cattle［J］.Virulence，2014，5（2）：297－302.

［17］ Ruettger A，Nieter J，Skrypnyk A，et al.Rapid spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria by use of a microarray system with automatic data processing and assignment［J］.J Clin Microbiol，2012，50（7）：2492－2495.

［18］ Je S，Ku B K，Jeon B Y，et al.Extent of Mycobacterium bovis transmission among animals of dairy and beef cattle and deer farms in South Korea determined by variable－number tandem repeats typing［J］.Vet Microbiol，2015，176（3－4）：274－281.

［19］ Bolado－Martinez E，Benavides－Davila I，Candia－Plata Mdel C，et al.Proposal of a screening MIRU－VNTR panel for the preliminary genotyping of Mycobacterium bovis in Mexico［J］.Bio Med Res Int，2015，2015：416479.

［20］ Yang L，Wang C，Wang H，et al.Evaluation of MIRU－VNTR for typing of Mycobacterium bovis isolated from Sika deer in Northeast China［J］.BMC Vet Res，2015，11（1）：93－99.

［21］ Gagneux S，DeRiemer K，Van T，et al.Variable host－pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis［J］.Proceed Nat Acad Sci USA，2006，103（8）：2869－2873.

［22］ Huard R C，Fabre M，de Haas P，et al.Novel genetic polymorphisms that further delineate the phylogeny of the Mycobacterium tuberculosis complex［J］.J Bacteriol，2006，188（12）：4271－4287.

［23］ Cole S T，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393（6685）：537－544.

［24］ Jamieson F B，Teatero S，Guthrie J L，et al.Whole－genome sequencing of the Mycobacterium tuberculosis Manila sublineage results in less clustering and better resolution than mycobacterial interspersed repetitive－unit－variable－number tandem－repeat（MIRU－VNTR）typing and spoligotyping［J］.J Clin Microbiol，2014，52（10）：3795－3798.

［25］ Chaoui I，Zozio T，Lahlou O，et al.Contribution of spoligotyping and MIRU－VNTRs to characterize prevalent Mycobacterium tuberculosis genotypes infecting tuberculosis patients in Morocco［J］.Inf Gen Evol，2014，21：463－471.

［26］ Streit E，Baboolal S，Akpaka P E，et al.Finer characterization of Mycobacterium tuberculosis using spoligotyping and 15－loci MIRU－VNTRs reveals phylogeographical specificities of isolates circulating in Guyana and Suriname［J］.Inf Gen Evol，2015，30：114－119.