甲醛对小鼠器官组织内cAMP含量的影响及其机理探讨

曹凤华， 李 慧， 张玉超， 刘志敏， 梅宇飞， 尚 帅， 杨 旭， 丁书茂

(华中师范大学 生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室， 武汉 430079)



甲醛对小鼠器官组织内cAMP含量的影响及其机理探讨

曹凤华， 李 慧， 张玉超， 刘志敏， 梅宇飞， 尚 帅， 杨 旭， 丁书茂*

(华中师范大学 生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室， 武汉 430079)

为探讨甲醛是否通过信号分子途径影响造血系统的代谢调节，选用雄性Balb/c小鼠为研究对象，采用动态吸入方式染毒7 d，每天8 h，染毒浓度分别为0，0.5，1.0，3.0 mg/m3.染毒结束后，检测小鼠脑、血浆、骨髓中cAMP含量变化.结果表明，在不同浓度的甲醛暴露条件下，与空白对照组相比，脑组织中cAMP含量没有显著性变化；血浆中cAMP含量与对照组相比，0.5、3.0 mg/m3染毒组出现极显著性差异(P<0.01)，1.0 mg/m3染毒组出现显著性差异(P<0.05)；骨髓中cAMP含量与对照组相比，0.5，1.0，3.0 mg/m3染毒组都出现显著性差异(P<0.05).研究表明，甲醛暴露对造血系统的毒性与胞内信号分子cAMP传导途径相关.

甲醛； 小鼠； cAMP； 机制

甲醛是一种常见的装修型室内空气污染物[1-2]，甲醛暴露对动物甚至人类的毒性作用是多种多样的，不仅对免疫系统和生殖系统产生毒性，还具有遗传毒性、神经毒性和致癌作用[3].2004年，IARC明确指出：甲醛能严重影响人类健康，并确定甲醛是A1组人类致癌物[4].2011年11月，美国国立卫生研究所确定甲醛暴露可以引发白血病[5]，但诱导人感染白血病产生的机制尚不清楚.

甲醛与白血病关系的研究，关键在于造血系统是否受甲醛暴露影响，其中，骨髓组织是一个非常重要的靶器官.Heck[6]等的实验结果表明，体内甲醛浓度一直保持在恒定水平，不随外界甲醛浓度改变而改变，但有研究表明吸入性甲醛对血液、骨髓等组织存在一定的毒性[7-8].甲醛也是一种生物内源性有机化合物，甲醛污染所造成的毒性，很可能不是甲醛分子本身具有毒性，而是直接进入到组织后，破坏机体甲醛浓度的平衡，作为信号分子干扰了造血系统的代谢调节.

3’，5’-环磷酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate，cAMP)是最早发现的细胞内信使，由于参与细胞内多种调节机制，将cAMP称为第二信使，它是ATP在腺苷酸环化酶(AC)的作用下生成，在正常细胞中的含量甚微.许子亮[9]等的研究表明，血中cAMP含量的变化与白血病及再生障碍性贫血症有相关性.为研究吸入性甲醛是否以信号分子的途径对造血系统机制产生影响，选择小鼠骨髓、血浆、脑为研究材料，检测其cAMP含量的变化，以探索甲醛引起白血病的分子机理.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性Balb/c小鼠，购于湖北省预防医学科学院动物实验中心.

1.2 主要试剂和仪器

试剂:10%的甲醛溶液(Sigma公司)；小鼠环磷酸腺苷ELSA检测盒(济南朋远生物技术有限公司).

仪器:HOPE-MED 8050动式染毒控制系统；4160-2型甲醛测定仪(Interscan公司)；冷冻离心机(Eppendof-5415R)；全波长酶标仪(BIO-TEK，美国)等.

1.3 实验方法1.3.1染毒 将24只Balb/c小鼠随机分为1个对照组和3个染毒组，每组6只，甲醛经HOPE-MED 8050动式染毒控制系统调配后，持续稳定地输出浓度为0.5 mg/m3[10]，1.0 mg/m3，3.0 mg/m3[11]的甲醛气体，染毒组在染毒舱中连续动态染毒7 d，每天8 h.在染毒期间，所有小鼠禁止进食和饮水.1.3.2小鼠血浆的采集 本实验采用心脏取血的方法进行采血.染毒结束后，腹腔注射麻醉剂(1%戊巴比妥钠溶液，生理盐水配制)使各染毒组小鼠麻醉.每只小鼠的麻醉剂量依小鼠体重而定:0.02 mL/kg.待小鼠彻底麻醉以后，用一次性1 mL注射器抽取950 μL～1 000 μL血液.抽血前每只注射器先抽取少量浓度为15 g/L的EDTA(抗凝剂)来回浸润.抽血结束后立即将得到的血液注入新的装有少量抗凝剂的EP管中，3 000 r/min离心15 min，取上清，用于cAMP含量的检测.

1.3.3 小鼠脑组织匀浆的制备 心脏取血后，用颈椎脱臼法处死小鼠，立即取脑组织，根据小鼠环磷酸腺苷ELSA检测盒说明书，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，用滤纸拭干，脑组织加生理盐水制成10%匀浆液，低温离心后取上清，用于cAMP含量的检测.

1.3.4 小鼠骨髓细胞的制备 取出双侧股骨，用1 mL生理盐水吹出骨髓组织细胞，4℃，500 g离心5 min，弃上清.配制骨髓组织细胞悬液，浓度为1×106个/mL.取细胞悬液1 mL，加60 μL细胞裂解液，裂解20 min，混匀5次，再裂解20 min，4℃，12 000 g离心5 min，取上清，用于cAMP含量的检测.

1.3.5 cAMP含量的测定 小鼠脑、血浆、骨髓组织中cAMP含量的测定，严格按照小鼠环磷酸腺苷ELSA检测盒说明书进行测定.测得结果后，按要求作标准曲线，求算样品中cAMP 含量.

2 实验结果

2.1 气态甲醛暴露对小鼠血浆中cAMP含量的影响

不同浓度气态甲醛染毒下小鼠血浆中cAMP含量如图1所示，随着染毒浓度的升高，cAMP含量先升高后降低，其中，1.0 mg/m3染毒组与对照组存在显著差异(P<0.05)，0.5、3.0 mg/m3染毒组与对照组存在极显著差异(P<0.01).

2.2 气态甲醛暴露对小鼠骨髓组织中cAMP含量的影响

如图2所示，不同浓度气态甲醛染毒下，小鼠骨髓组织cAMP含量均升高，0.5、1.0、3.0 mg/m3染毒组与对照组均存在显著性差异(P<0.05).

(与对照组相比, *: P< 0.05， **: P< 0.01)

(与对照组相比， *: P< 0.05)

2.3 气态甲醛暴露对小鼠脑组织中cAMP含量的影响

如图3所示，不同浓度气态甲醛染毒下，小鼠脑组织cAMP含量没有发生显著性变化.

(与对照组相比,*: P< 0.05)

3 讨论

许多文献表明，cAMP在细胞代谢及多种生理效应的实现中具有关键的作用，外源cAMP具有抑制肿瘤细胞生长、促进分化的作用，神经递质的传递、基因表达、激素调节、免疫反应以及细胞的增殖和分化均与cAMP有关[12-14]，而且在肿瘤细胞内普遍存在着cAMP下降现象.在白血病致病机理的研究中，很多研究结果表明，白血病患者血液中cAMP含量低于正常值[9-15]，本实验结果也表明甲醛染毒后，各组织器官中cAMP含量发生变化，由此可以推断甲醛对造血系统的毒性很可能与cAMP信号分子途径存在一定联系.

3.1 甲醛暴露对小鼠血浆、骨髓、脑中cAMP含量的影响

本实验结果表明，小鼠血浆、骨髓、脑三者的cAMP含量的本底水平存在差异，甲醛染毒后，cAMP含量变化趋势也不相同.

小鼠血浆中cAMP含量出现了从高到低的显著性变化.这种情况的出现值得思考，0.5 mg/m3染毒组显著性升高的原因与Suat Erdogan[17]等的研究结果相关，机体内cAMP含量随承受剌激强度的增加显著增多，而cAMP含量升高能够抵抗炎症并且保护组织.在低浓度甲醛暴露时，小鼠自身的防御系统能够通过提高cAMP含量从而减少甲醛毒性对机体的损伤.3.0 mg/m3染毒组出现显著性降低是因为，当处于高浓度甲醛暴露环境中时，小鼠自身的防御系统因无法继续维持而崩溃，最终导致cAMP含量极显著性降低，组织器官受到损失，严重时可致癌.

小鼠骨髓中cAMP含量出现显著性升高.甲醛暴露能够影响小鼠骨髓细胞的分裂与分化，对骨髓细胞的生长产生毒害作用[7]，而cAMP信号通路下游的cAMP 反应元件结合蛋白(CREB)能够促进一些控制骨髓细胞增殖和分化的基因表达[18]，所以cAMP含量的升高，可能刺激控制骨髓细胞增殖和分化的基因表达，从而减少甲醛暴露引起的骨髓细胞的损伤，但如果小鼠持续处于这种甲醛暴露环境中，这种防御机制无法维持身体正常运转时，机体则会趋向于发生癌变.

有研究表明，脑损伤后会释放各种神经介质、递质和自由基，通过细胞内信号转导机制，可导致血脑屏障开放，但提高内皮细胞内cAMP含量，能明显阻止血脑屏障开放[16].本实验中，小鼠脑中cAMP含量没有发生显著性变化，这说明短时间的甲醛染毒并没有造成严重的脑损伤，血脑屏障有效的保护了脑组织，小鼠自身的血脑屏障以及信号转导系统在一定程度上能够自我恢复，从而减少机体损伤.

3.2 甲醛引起cAMP含量变化的机理

Peter Feick[19]等人的研究表明，低剂量甲醛对肠上皮细胞的暴露能够导致MAP激酶的活化和整联蛋白Paxillin酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化，本实验结果表明，甲醛确实能够引起cAMP含量的变化，这说明甲醛分子可能通过MAPK信号通路的级联反应传递信号，而MAPK信号通路对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用[20]，所以最终甲醛分子可以引起DNA转录.

cAMP途径是MAPK信号通路中非常重要的一条路线，推测甲醛通过cAMP途径引起DNA转录发生的机理如图4所示，在整个级联反应中，甲醛作为信号分子首先与受体结合通过G蛋白偶联受体活化腺苷酸环化酶(AC)，导致细胞内cAMP浓度增高，从而激活下游蛋白激酶A(PKA)[21-22]，PKA激活Raf蛋白激酶，活化了的Raf 再激活Mek，Mek 经磷酸化最终激活Erk，Erk 能够进入细胞核内，活化cAMP 反应元件结合蛋白(CREK)，进而启动基因的转录[23]，因此，通过甲醛染毒可引起cAMP途径中各级激酶的异常激活，最终引起基因的异常表达，严重时可引发癌症.

图4 甲醛通过cAMP途径引起DNA转录机理图

4 结语

本实验研究结果表明，甲醛暴露对造血系统造成的毒性与信号分子途径存在一定的关系，能够引起胞内信使cAMP含量的变化，这为从信号分子途径探讨白血病的致病机制提供了一些支持.

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Study on the mechanism of the change of cAMP concentration in mouse tissues induced by formaldehyde exposure

CAO Fenghua， LI Hui， ZHANG Yuchao， LIU Zhimin， MEI Yufei，SHANG Shuai， YANG Xu， DING Shumao

(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Science，Central China Normal University， Wuhan 430079)

In order to explore whether formaldehyde have an effect on the metabolic regulation of hematopoietic system through the signalling pathway， SPF grade Balb/c malemice were selected as the target in this study. After a 7 day(8 h/d) dynamic and inhalational exposure to gaseous formaldehyde with three different concentrations (0.5 mg/m3， 1.0 mg/m3and 3.0 mg/m3， respectively)， the concentrations of cAMP in brain， plasma and bone marrow tissue of mice were determined. The contents of cAMP in brain tissue did not change under different concentrations of formaldehyde compared with the control group. The contents of cAMP in plasma of mice all changed compared with the control group， the 0.5， 3.0 mg/m3group appeared extremely significant difference (P<0.01)， the 1.0 mg/m3group appeared significant difference (P<0.05). The contents of cAMP in the bone marrow of all the experimental groups had significant difference compared with that of control group (P<0.05). The results indicated that the toxicity of formaldehyde on mouse hematopoietic system is related to intracellular cAMP signaling pathways．

formaldehyde; mice; cAMP; mechanism

2014-04-30.

国家自然科学基金重点项目(51136002).

1000-1190(2015)01-0098-04

R995

A

*通讯联系人. E-mail: dingsm@mail.ccnu.edu.cn.