加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织miRNA-146a表达的影响*
2015-03-22晁旭董昌虎李宏任清维郑旭锐王国全
晁旭董昌虎李宏任清维郑旭锐王国全
陕西中医学院(咸阳 712046)
加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织miRNA-146a表达的影响*
晁 旭△董昌虎△李 宏△任清维▲郑旭锐王国全
陕西中医学院(咸阳 712046)
目的:检测加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织的病理和miRNA-146a表达的影响。方法:加味四逆散治疗二甲基亚硝胺( DMN)诱导的肝纤维化大鼠后,通过HE染色观察治疗前后肝组织病理变化,并通过RT-PCR技术检测miRNA-146a的表达。结果:与模型组比较,加味四逆散治疗组大鼠肝组织汇管区可见轻度炎症,纤维结缔组织增生程度较治疗前减轻,有显著性差异(P≤0.05)。治疗后的大鼠肝组织中miRNA- 146a 的表达明显升高。结论:加味四逆散科通过调节miRNA-146a的表达实现对肝纤维化的逆转。
MicroRNA (miRNA)是一类长度为18-26nt非编码RNA,它可与靶基因3,端非编码区的特异序列结合,对靶基因进行转录后水平负调控,进而影响细胞的多种生理和病理过程[1,2]。研究表明,miRNA这一转录后水平的调控因子可通过调控细胞增殖、凋亡、脂代谢/脂肪酸代谢等一系列相关通路在许多肝脏疾病的发生发展过程中发挥重要作用[3]。有关miRNA在肝脏疾病的发生和治疗中的作用已经成为当前研究的热点。
miRNA-146a基因是位于人体5号染色体LOC285628基因的第二个外显子区,它作为免疫和炎症反应的负调控因子,有助于自体免疫疾病的恢复,如系统性红斑狼疮,类风湿关节炎等[4-5]。miRNA-146a 可以通过激活Smad4调控TGF-β1诱导的肝星状细胞,进而导致肝纤维化[6]。
加味四逆散是临床上用于治疗慢性病毒性肝炎的中药复方,具有良好的防治肝纤维化作用[7-9]。但是,加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织中miR-146a表达的影响及其生理意义尚未见文献报道。本研究以二甲基亚硝胺( DMN)诱导的肝纤维化大鼠为材料,采用逆转录聚合酶链式反应技术,检测加味四逆散治疗前后肝组织中miRNA-146a的表达,探讨加味四逆散对miR-146a表达的影响。
1 材料与方法 1.1 药品及试剂 加味四逆散由黄芪、丹参、姜黄、桃仁、柴胡、甘草、白芍、枳壳八种中药材组成,组方中各种药物的质量比为10∶10∶5∶2.5∶1. 5∶1∶5∶2.5。所有药物均购自陕西中医学院附属医院中药房,并经本院中药教研室鉴定。所有药物称量好后,加注射用水400 mL,煎煮20 min后,取滤液200 mL。再按上述操作重复煎煮1次。然后将两次煎煮的滤液混合,水浴蒸发至浓度为3.5 g /mL。秋水仙碱、TRIzol Regent购自美国Invitrogen公司、qRT-PCR 逆转录聚合酶链式反应试剂盒购自大连宝生物工程有限公司、二甲基亚硝胺购自Sigma-Aldrich(中国)公司、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 肝纤维化大鼠制备 60只清洁级SD大鼠(体重为180 ± 20 g,购自西安交通大学医学院实验动物中心)适应性饲养1周后,随机分为6组,每组10只。分别为空白对照组、模型对照组、加味四逆散大剂量组、加味四逆散中剂量组、加味四逆散小剂量组和秋水仙碱组。除空白对照组外,其余各组动物均以10 mL·kg-1体重的剂量灌胃DMN (5 g·L-1),每日1次,每周连续3d,连续灌服4周。
1.3 给 药 空白对照组和模型对照组均以4 mL·kg-1体重的剂量进行生理盐水灌胃; 秋水仙碱组以0.01 mg·kg-1体重的剂量进行灌胃给药;加味四逆散小剂量组、中剂量组和大剂量组分别以5 mL·kg-1、10 mL·kg-1和15 mL·kg-1体重的剂量灌胃加味四逆散煎煮液。以上各组用药均1次/d,连续给药30 d。
1.4 病理标本制作 给药结束后,处死动物,取部分新鲜的肝组织用生理盐水冲洗后,10%的甲醛固定,然后进行石蜡包埋,最后进行HE染色。按照病理组织学分级标准[10]分析治疗前后肝组织纤维化程度。
1.5 miRNA-146a表达分析 取各组实验动物新鲜肝组织,用TRIzol 试剂提取总RNA,经逆转录反应得到cDNA。将逆转录得到的cDNA分别按1、10、100 和1 000的倍数稀释,然后在ABI 7300 Real-timePCR 仪( Applied Biosystems) 进行PCR。miRNA-146a引物为5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3',下游引物为5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3'),内参基因U6 small nuclear RNA( snRNA)的上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')。反应完后,计算各组样品中miRNA-146a 和U6snRNA 的平均Ct值,然后用U6 snRNA对模型组和治疗组样品中miRNA-146a的Ct 值进行校正,得出个实验组的ΔCt,再进行归一化处理,得到ΔΔCt,最后用相对定量法( RQ = 2-ΔΔCt) 计算miRNA-146a 基因表达的差异。
1.6 统计学方法 采用SPSS17.0 软件进行数据处理,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 大鼠症状表现 给药期间,空白组大鼠皮毛光滑,大便及饮食饮水量正常。模型对照组动物皮毛凌乱无光泽,饮食饮水量明显减少、反应迟钝、粪便稀薄。秋水仙碱治疗组动物治疗3周后,进食、摄水量正常,大便正常,精神状态好转。加味四逆散小剂量治疗组与空白对照组动物相比较,生活状态无明显区别。而加味四逆散中剂量治疗组和大剂量治疗组动物3周后,进食、摄水量和大便趋于正常,生活状态比治疗前显著改善。
2.2 组织病理学分析结果 HE染色结果显示,模型组动物肝组织汇管区及小叶内有中度炎性细胞浸润;大量胶原沉积于汇管区,呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。加味四逆散小剂量治疗组与模型组动物肝组织结构无显著差异。而与模型组比较,秋水仙碱治疗组、加味四逆散中剂量治疗组和大剂量治疗组大鼠仅在汇管区可见轻度炎症,纤维结缔组织增生程度较治疗前明显减轻。该结果证实了加味四逆散组对肝纤维化良好的治疗作用。
表1 各组大鼠肝脏组织纤维化分级
组 别n肝纤维化分级-±+空白对照组模型对照组秋水仙碱组加味四逆散小剂量组加味四逆散中剂量组加味四逆散大剂量组1010101010101003022003134022132041411
2.3 肝组织中miRNA-146a的表达 肝组织中miRNA-146a的表达结果显示,相对于空白对照组,二甲基亚硝胺( DMN)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中miRNA- 146a 的表达显著降低(P< 0.05)。秋水仙碱治疗组、加味四逆散中剂量治疗组和大剂量治疗组大鼠肝组织中miRNA- 146a 的表达明显升高,与空白对照组无统计学差异,见图1。
图1 各实验组大鼠肝脏组织中miRNA-146a的表达
3 讨 论 近年来,随着遗传学及肝纤维化机制研究的深入,microRNA(miRNA)在肝纤维化进程中的作用逐渐被重视。Microarry分析结果显示,相对于静息状态的肝星状细胞(HSCs),被TGF-βl激活的HSCs中miR-146a 的表达显著地下调[11]。进一步研究显示,miRNA-146a以Smad4为作用靶点,通过TGF-βl/Smads信号通路抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖;其机制是miR-146a可以Smad4 mRNA的3'端的非编码区结合,从而使Smad4基因翻译失活[12-13]。
加味四逆散是在临床上用于治疗肝纤维化疗效确切的中药方剂,具有防止肝纤维化形成、阻断肝纤化发展、逆转肝纤维化进程等显著效果。本研究结果显示,相对于空白对照组,二甲基亚硝胺( DMN)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中miRNA-146a 的表达显著降低(P<0.05);而秋水仙碱治疗组、加味四逆散中剂量治疗组和大剂量治疗组大鼠肝组织中miRNA- 146a的表达明显升高。该结果提示我们,加味四逆散通过调节miRNA-146a的表达,实现对肝纤维化的逆转。但其具体机制,还需进一步研究。
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(收稿2014-06-11;修回2014-07-25)
Expression of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder
Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)
Chao XuDong ChanghuLi Honget al
Objective:To study the significance of pathological changes and miRNA-146a expression in liver tissue of Hepatic Fibrosis in Rats treated with Jiawei Sini powder. Methods :The pathology changes were observed by HE staining and expressions of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder were detected by SYBR Green quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ( qRT-PCR) analysis.Results: There were only mild inflammation in portal area and ease of fibrous connective and the expression of the miRNA-146a significantly increased in liver tissue of hepatic fibrosis rats treated with Jiawei Sini powder.Conclusion :Jiawei Sini powder could regulate the expression of miRNA-146a to inhibit hepatic fibrosis.
Jiawei Sini powder Hepatic fibrosis miRNA-146a expression Animal,experiment Rats
*咸阳市科学技术研究计划项目(2014k04-02)
加味四逆散 肝纤维化 miRNA-146a 表达 动物,实验 大鼠
R563
A
10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.057
△陕西中医学院第二附属医院(咸阳 712000)
▲陕西省周至县人民医院(周至710400)