PCR荧光法和PCR-反向斑点杂交法检测人乳头瘤病毒比较研究

西电集团医院(西安710077)

王海宁 剌 梅△ 李 欣 杨小青 杨小艺

PCR荧光法和PCR-反向斑点杂交法检测人乳头瘤病毒比较研究

西电集团医院(西安710077)

王海宁 剌 梅△李 欣 杨小青 杨小艺

目的：研究PCR荧光法和PCR-反向斑点杂交(PCR-RDB)法检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈病变筛查中的意义。方法：收集271例女性宫颈脱落细胞样本，分别采用PCR荧光法和PCR-RDB法进行HPV检测，比较两种方法检测结果的一致性;另设立双阳组(两种方法检测8种高危型HPV均为阳性的患者)和对照组(其余患者)，以病理检测为标准，比较两者阳性率之间的差别。结果：两种方法检测8种HPV亚型显示有82.66%(224/271)的样本，以检测结果一致，两者比较差异无统计学意义；在宫颈组织病理活检中，双阳组患者病变率为42.11%(24/57)，对照组为10.49%(15/143)，两者比较差异有统计学意义。结论：PCR荧光法和PCR-RDB法用于HPV检测一致性较好，高危型HPV检测是宫颈癌筛查的有效方法。

高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)持续感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的主要因素之一[1]。本研究拟采用PCR荧光法和PCR-反向斑点杂交(PCR-RDB)法同时对门诊就诊患者宫颈脱落细胞进行检测，比较研究两种方法检测HPV的准确性及一致性，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 以2014年6月至2014年12月本院妇产医院门诊就诊的271例女性为研究对象，采集宫颈脱落细胞，年龄20～72岁，平均年龄37.3岁。所有患者有性生活史、非孕期，取材时要求月经干净期，检查前3d不得使用阴道内药物或进行阴道冲洗。

2 试剂与仪器 高危型HPV(8个型)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)和HPV基因分型检测试剂盒(PCR-反向斑点杂交法)均由广州中山大学达安基因有限公司提供；仪器是由广州中山大学达安基因有限公司提供的DA7600型扩增仪。

3 取 样 无菌条件下采用特制宫颈刷深入宫颈管内2cm，旋转数周后并停留片刻取出，沿刷柄折痕折断后放入装有2ml细胞保存液的保存管中，-20℃保存待测。

4 HPV检测方法 PCR荧光法试剂盒能定量检测宫颈脱落细胞标本中常见的8种(16、18、31、33、45、52、56、58型)高危型HPV-DNA，该试剂盒的检测下限为5.0×102基因拷贝，线性范围5.0×102～5.0×106基因拷贝，无法具体分型；HPV基因分型检测试剂盒(PCR-RDB法)虽不能定量，但可同时分型检测19种HPV亚型，包括高危型16种(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和cp8304)和低危型3种(6、11和43)，从而判断病人是单一亚型感染或是混合感染。两种方法的操作及结果判定均严格按照试剂盒说明书进行。

5 病理检查 对271例患者行液基细胞学(TCT)检测及阴道镜下宫颈组织病理活检，发现异常病灶则进行多点活检，如未发现则常规取点活检。以病理结果为判断标准，病理诊断阳性包括宫颈上皮内瘤变及宫颈癌，按病变程度分为CINI、CINII、CINIII及浸润癌[2]。比较两种PCR方法检测8种高危型HPV均为阳性的患者(双阳组)和其余患者(对照组)病理检测阳性率之间的差别。

6 统计学方法 采用χ2检验对两种方法检测HPV进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义；利用Kappa检验分析两种方法的一致性。

结 果

1 PCR荧光法和PCR-RDB法HPV检测结果比较 271例宫颈脱落细胞标本中，PCR荧光法检测阳性103例，阳性率38.01%(103/271)；PCR-RDB法检测阳性116例，阳性率42.8%(116/271)。统计两种方法对于能够共同检测出的8种高危型HPV的检测情况，结果显示一致率为82.66% (224/271)，差异无统计学意义(P>0.05)，两者间的一致性较好，Kappa=0.64，95%可信区间(0.5223，0.7592)，见表1。

2 TCT及宫颈组织病理活检检测结果分析 双阳组患者中有57例进行了TCT检测及阴道镜下宫颈组织病理活检，结果提示有病理学改变的有24例，病变率42.11%(24/57)。其余185例患者中有143例(对照组)进行了病理学检查，结果有15例宫颈组织发生病理学改变，病变率10.49%(15/143)。两者相比差异有统计学意义(χ2=25.95，P<0.01)，见表2。

表1 PCR荧光法和PCR-RDB法检测8种HPV高危亚型结果比较

注：χ2=3.60，P>0.05；Kappa=0.64，95%可信区间(0.5223，0.7592)。

表2 双阳组和对照组病理学检测结果比较

注：双阳组：PCR荧光法和PCR-RDB法检测HPV8种高危亚型均为阳性的患者；对照组：除双阳患者外，两项检测均为阴性的患者和两项结果不相符的患者；χ2=25.95，P<0.01

讨 论

本研究中通过对HPV两种检测方法的比较，发现对于PCR荧光法能够检测的8种高危型HPV亚型而言，一致性为82.66 %，Kappa值为0.64。有17.34%的患者两种方法检测结果不一致，其中30例PCR-RDB法检测阳性患者，而PCR荧光法检测为阴性，分析其24例患者的PCR亚型不在PCR荧光法能够检测的8种亚型之内，另有6例在8种亚型之内，但PCR荧光法并未检出；还有17例PCR荧光法阳性而PCR-RDB法检测为阴性。PCR反应的缺点是扩增产物之间容易交叉污染从而造成假阳性[3]，且由于两种试剂盒PCR反应过程所应用的引物、酶和反应体系不同，两种检测方法检测的HPV基因型别不同，不同型别混合感染时有可能干扰扩增结果，所以检测结果的不一致考虑与方法学差异及试剂敏感度有关。对于本研究中的8种HPV高危亚型的检测，经分析两种方法的检测结果差异无统计学意义， 但两种方法均存在一定程度的错检或漏检。因此在临床检验中将二者结合检测，能大大提高HPV检测的准确率。

本研究中，根据受检患者的病理学检测结果分析，双阳组患者的宫颈组织病变率大大高于对照组患者，差异有统计学意义。目前研究表明，有已知20余种HPV型别与癌症有关[4]。PCR荧光法中包含的8种型别都是引起宫颈癌比较常见的基因亚型。本研究中42.11%的高病变率验证了这一理论。长时间持续性地高危型HPV感染，综合机体自身免疫因素、环境卫生及心理因素，导致其基因组整合进宿主染色体内，引起宫颈癌的转化和发生[5]。因此对于HPV检测阳性，但TCT及病理学检测结果正常的患者，追踪及随访有利于监测HPV的预后[6-7]。

总之，PCR荧光法和PCR-RDB法联合检测能够提高HPV检测的准确率，预测受检者罹患宫颈癌的风险度及决定筛查间隔，是评估疫苗的有效方法，对降低宫颈癌的发生有重要的临床意义。

[1] Schiffman M,Castle PE. Humann papillomavirus: epidemiology and public health [J].Arch Pathol Lab Med,2003,127(8):930-934.

[2] Okonkwo C, Ezeanochie M, Olagbuji B. Physical after effects and clients satisfaction following colposcopy and cervical biopsy in a Nigerian population [J]. Afr Health Sci, 2013, 13(2): 402-406.

[3] 王 薇,马 丁.不同人乳头瘤病毒检测方法的临床应用价值[J].实用妇产科杂志,2013,3(29):165-167.

[4] 杨小艺,李 娜,王海宁.1083例妇女感染HPV状况分析[J].陕西医学杂志,2012,41(6):739-741.

[5] 张 燕,黄丽慧.高危型HPV定量检测在宫颈癌筛查中的应用[J].内蒙古中医药,2014,30:93-94.

[6] 王越月,周志辉,刘 芳,等.女性HPV感染208例病理分析[J].陕西医学杂志,2011,40(2):202-203.

[7] Stormo AR, Espey D, Glenn J,etal. Findings and lessons learned from a multi-partner collaboration to increase cervical cancer prevention efforts in Bolivia [J]. Rural Remote Health, 2013, 13(4): 2595.

(收稿：2015-02-10)

宫颈疾病/诊断 乳头状瘤病毒科/分析 聚合酶链式反应 酶免疫斑点检测

R759

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.068

△ 延安大学咸阳医院检验科