高效液相色谱法测定土茯苓中落新妇苷、阿魏酸、白藜芦醇含量

2015-03-22孙兢喆沈阳市第二中医医院沈阳110100

陕西中医 2015年1期

孙兢喆沈阳市第二中医医院 (沈阳 110100)

·方药纵横·

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目的：确立土茯苓药材中阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇三种指标成分的含量。方法：应用高效液相色谱法(HPLC)测定，色谱条件为ODS-C18色谱柱(5μm，150x4.6mm)，流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min，测定波长290 nm。结果：阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇分别在0.02088～0.1044 ug、0.4284～2.142 ug、0.0432～0.216ug范围内线性关系良好；样品中阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇评价含量分别为0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。结论：该方法操作简单、准确，可作为土茯苓质量控制方法。

土茯苓来源是百合科植物光叶菝葜(SmilaxglabraRoxb)的干燥根茎，始载于《名医别录》名禹余粮，《本草纲目》始称土茯苓。近年来有关土茯苓对心血管系统、利尿、抗炎、抑菌及解毒等方面药理作用研究较多[1]；临床中多用来治疗慢性胃炎、急性睾丸炎、滴虫性阴道炎、梅毒、咳喘、流行性腮腺炎和小儿疳积[2，3]；在成分测定方面，多以落新妇苷或白藜芦醇为指标建立相应高效液相色谱法(HPLC)检测方法[4-9]。我国颁布的药典中，仅对土茯苓中的落新妇苷进行含量测定，并为优化土茯苓质量评价的方法，本试验采用HPLC法测定本药阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇的含量，现报道如下。

1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司)，超声波提取器(AS3120A，上海)，电热恒温鼓风干燥箱(GZX-GF40X45，上海)，电子天平(ALC-110.4，上海)。

1.2 试剂液相用水为超纯水，乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇对照品(成都曼思特公司)，液相色谱归一化法测定三种对照品纯度均大于99.0%。土茯苓饮片于2014年2月采购自安徽亳州药材交易中心，10个批次的产地分别为：安徽(新兴中药厂)、浙江(黄岩医药药材有限公司)、江西(双华中药饮片厂)、福建(市宏发中药材有限公司)、湖南(同仁堂饮片厂)、湖北(协和堂饮片厂)、广东(广印堂饮片厂)、广西(永刚饮片厂)、四川(方敏饮片厂)、云南(沪谯饮片厂)，经辽宁中医药大学王海波教授鉴定为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎。

2 方法与结果 2.1 色谱条件 ODS-C18色谱柱(5μm，150×4.6mm)，柱温30℃，流动相为乙腈0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min。

2.2 测定波长的确立经参考文献，并经紫外—可见分光光度法测定，综合三种对照品吸收情况，确定测定波长为290nm。

2.3 溶液制备对照品制备：精密称取阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL各含0.1mg、0.2mg、0.1mg的对照品储备液溶液备用，再按照试验需要加甲醇稀释至不同浓度。供试品溶液制备：土茯苓药材粉碎，取粉末1.5g，精密称定，加70%甲醇适量，加热回流提取两次，一次2h、一次1.5h。提取液合并，水浴浓缩至干，残渣加甲醇适量溶解，定量转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.4 方法学考察 2.4.1线性范围考察：取阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇对照品溶液，分别精密吸取3、6、9、12、15μL溶液，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，以对照品浓度(mg/L )为横坐标，绘制标准曲线。结果阿魏酸的回归方程为y = 2087.2x + 1.77 (r=0.9993)；落新妇苷的回归方程为y = 85.362x + 58.07(r= 0.9992)、白藜芦醇的回归方程为y = 113.57x + 17.49(r= 0.9995)。

2.4.2精密度实验：取本品1.5g，精密称定，制成供试品溶液，在4℃低温保存。精密吸取同一供试品溶液20uL，按2.3项下方法操作，连续进样5次，测定色谱峰面积，相对标准偏差(RSD)(n=5)分别为1.8% 、2.0% 、3.0% ，表明该方法的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验：取晒干桑叶供试品溶液分别于0，3，6，12h进样，进样体积20uL，记录峰面积。阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇含量的RSD分别为2.1% 、2.5% 、2.3% ，表明样品溶液在12h内基本稳定。

2.4.4重复性试验：取土茯苓药材样品，分别称取五份，每份1.5g，精密称定，按 2.3项下供试品溶液的制备方法操作，制备样品。分别精密吸取20uL，测定阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇含量，RSD(n=5)分别为1.0% 、2.5% 、2.9% ，表明本测定方法的重现性良好。

2.4.5回收率实验：精密称取已知准确含量的本品(阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇含量分别为0.06209mg/g、0.01609mg/g、0.02152mg/g)5份，各0.75g。分别置圆底烧瓶，精密加入阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇对照品适量，按样品制备方法操作。实验结果提示：阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇的回收率分别为101.5%、98.6%、99.60% ，RSD分别为2.9%、2.6%、3.5%。

表1 土茯苓药材加样回收率测定结果

2.5 样品测定结果分别测定10批样品中阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇含量，含量范围分别为0.03164～0.08176 mg/g、0.00682～0.02023mg/g、0.01624～0.02618mg/g，平均含量为0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。

3 讨论本实验较我国药典新增了土茯苓阿魏酸和白藜芦醇的含量检测，细化了土茯苓的质量检测标准。测定结果表明阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇的线性范围分别是0.02088～0.1044μg(r= 0.9993)、0.4284～2.142 μg(r=0.9992)、0.0432～0.216μg(r=0.9995)。方法稳定，重复性良好，结果准确，可作为土茯苓的质量控制方法。

本次研究中，分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.025%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%磷酸水、以及乙腈-磷酸-三乙胺水溶液等不同组成、不同比例的流动相系统。发现乙腈-0.05%磷酸水溶液组成的流动相系统对样品溶液中各种组分的分离最好，阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇三个测定成分与相邻组分分离度最好。经筛选不同比例后确定18：82比例等度洗脱条件即可保证分离效果。

在供试品溶液制备方法考察中，进行了提取方法、提取溶剂的比较。回流提取样品含量高于超声提取法；提取溶剂考察中，70%甲醇提取效果优于甲醇溶剂。

在选定的色谱条件下，供试品溶液中阿魏酸、落新妇苷、白藜芦醇与相邻组分分离度良好，阴性液无干扰，经方法学考察，方法的重复性、稳定性、精密度、回收率试验均符合有关规定。需要注意的是，在稳定性试验过程中，样品保存时间超过8h，白藜芦醇成分的含量变化明显，提示样品液需要尽快进行测定。

[1] 陈红梅，秀兰，吴占全.土茯苓的化学与药理研究进展[J].中国民族医药杂志，2008，14(11)：71-73.

[2] 仝玉柱.土茯苓治慢性胃炎[J].陕西中医,2000，29(01)：40.

[3] 卢晓.土茯苓为主治疗皮肤及血管疾病[J].陕西中医,2001，22(12)：766.

[4] 李磊，张宏桂，孙毅坤，等.土茯苓药材HPLC指纹图谱研究[J].中华中医药杂志，2007，22(4)：206．

[5] 李磊，张宏桂，乔延江，等.HPLC法测定土茯苓药材中落新妇苷和白藜芦醇的含量[J].药物分析杂志，2007，27(5)：654-656.

[6] 刘志刚，曾祥腾，孙维峰，等.正交试验优化土茯苓黄酮类成分提取工艺研究[J]．中华中医药学刊，2010， 28(3)：466-468.

[7] 苏红艳，刘玉强.高效液相色谱法测定土茯苓中薯蓣皂苷元的含量[J].辽宁中医药大学学报，2008,(5)：159.

[8] 方婧，付梅红，杨洪军，等.微波协助提取在中药饮片含量测定中的应用(3)-微波法与药典法测定土茯苓中落新妇苷含量比较[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(24)：42-43.

[9] 王清伟.萆薢、土茯苓、菝葜的临床鉴别及应用[J].陕西中医,2000，21(8)：378.

(收稿2014-09-01；修回2014-09-27)