复脉膏外敷对大鼠长春瑞滨外渗性损伤组织中VEGF的影响

周留勇 尤建良 单珍珠 张辰岑 龚时夏

(无锡市中医医院肿瘤科，无锡，214071)

复脉膏外敷对大鼠长春瑞滨外渗性损伤组织中VEGF的影响

周留勇 尤建良 单珍珠 张辰岑 龚时夏

(无锡市中医医院肿瘤科，无锡，214071)

目的：建立大鼠长春瑞滨外渗性组织损伤的理想实验模型，在此动物模型上研究复脉膏外敷对外渗性损伤组织中VEGF的影响，以探讨复脉膏外敷治疗化疗性静脉炎的疗效及机制。方法:42只大鼠随机分为2组：复脉膏组、50%硫酸镁组，21只/组，建立实验模型。2组大鼠左侧损伤处分别予复脉膏外敷、50%硫酸镁湿敷；右侧予生理盐水外敷作为对照组。在损伤后第1、4、7、11、14、18天，分别随机取3只大鼠，切除损伤部位的皮肤及皮下组织，固定标本，脱水、石蜡包埋，连续切片，采用免疫组化标记及图像分析方法，在电子显微镜下观察VEGF的表达情况。结果：VEGF阳性表达主要见于表皮细胞、血管内皮细胞、毛囊上皮细胞胞浆、渗出的巨噬细胞、增生的成纤维细胞胞浆。复脉膏外敷较硫酸镁湿敷及生理盐水外涂能明显刺激长春瑞滨外渗性损伤组织中VEGF的阳性表达(P<0.01)。结论:复脉膏外敷于损伤皮肤后能上调损伤组织中VEGF的表达，通过VEGF的生物学功能，进而促进损伤组织的愈合。因此，复脉膏可以用于防治化疗性静脉炎。

复脉膏；长春瑞滨；外渗性损伤；VEGF

癌症是危害人类健康的三大主要疾病之一，静脉点滴化疗药物是目前治疗癌症的重要方法之一。但绝大多数化疗药物对静脉有刺激作用，部分强刺激性的化疗药物易引起静脉炎，进而增加患者的痛苦，降低患者的生活质量，甚至影响化疗的顺利进行。所以，肿瘤内科医护人员必须重视：如何预防或减轻化疗性静脉炎，以保证化疗方案的顺利实施。

静脉点滴化疗药物会产生对血管的刺激，进而引起管壁的各种化学性炎症，常导致不同程度化疗性静脉炎的发生[1-4]。外周静脉单纯输注长春瑞滨引起的静脉炎甚至高达89.5%[5]。

我科使用中药制剂“复脉膏”预防和治疗化疗性静脉炎20余年，疗效显著，无明显不良反应。为了探讨复脉膏防治化疗性静脉炎的机理，为临床使用提供确凿有力的实验依据，我们进行了相关实验研究，现将复脉膏外敷对大鼠长春瑞滨外渗性损伤组织中VEGF的影响的实验研究，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SD大鼠60只，雌雄不限，(205±20)g/只，清洁级，由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证：SCXK(苏)2007-0001。

1.2 主要仪器 RM2135型石蜡切片机(德国LEICA公司)、CHK2-F-GS显微镜(日本OLYMPUS公司)、BX41图像采集系统(日本OLYMPUS公司)。

1.3 主要试剂 复脉膏(由无锡市中医医院制剂室提供)，长春瑞滨注射液(江苏豪森药业股份有限公司出品，批准文号：国药准字H19990278，规格：10 mg/瓶)，50%硫酸镁(上海鹤善实业有限责任公司出品)，鼠单抗VEGF多克隆抗体(工作浓度1：150)、免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂(美国EPITOMICS公司出品)，安尔碘Ⅱ型皮肤消毒剂(上海利康消毒高科技有限公司，生产批号：20111105)。

2 实验方法

2.1 皮肤准备 用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，以股骨小头为标志，其上方1.5 cm处作为中心，采用刮毛刀刮除直径约3.0 cm范围毛，用温清水洗净脱毛部位皮肤，观察48 h，脱毛部位皮肤完好。

2.2 实验模型 1)取SD大鼠18只，随机分为6组，3只/组，用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，安尔碘Ⅱ型皮肤消毒剂常规消毒，分别注射不同浓度(0.3、0.5、0.6、1.0、1.2、1.5 mg/mL)生理盐水稀释的长春瑞滨溶液，每只SD大鼠于左侧皮下注射0.2 mL，右侧皮内注射0.2 mL。长春瑞滨注射剂量均在大鼠耐受范围内。2)理想实验模型的确定：经观察和对照，将长春瑞滨稀释成1.0 mg/mL，采取皮内注射方式注射0.2 mL所形成的SD大鼠组织均一性损伤，确定为理想实验模型(见图1)。

2.3 实验步骤 1)取SD大鼠42只，随机分为2组：硫酸镁组、复脉膏组，21只/组。2)按上述理想实验模型的确定方法，建立实验模型。3)造模成功后1 h，2组SD大鼠左侧损伤处分别予50%硫酸镁湿敷(3次/d)、复脉膏0.2 g外敷(1次/d)；右侧损伤处均予生理盐水外敷作为对照组。共形成硫酸镁组21处、复脉膏组21处、对照组42处。4)在损伤后的第1、4、7、11、14、18天，2组SD大鼠分别随机取3只，予3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，常规消毒，切取外渗性损伤部位的皮下组织及皮肤(取皮肤创面及周围5 mm左右宽的组织)，生理盐水清洗，4%中性低聚甲醛缓冲固定液固定标本，固定48 h后，常规脱水、浸润、石蜡包埋，后连续切片。5)采用SP法：将上述所得切片，脱蜡至水，予3%双氧水以阻断内源性过氧化物酶，予非免疫兔血清以封闭，后在一抗4 ℃湿温盒中过夜，及二抗37 ℃温箱中30 min，DAB显色剂显色，予苏木精以复染，并透明封片。阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗。判定以胞浆出现棕褐色或棕黄色颗粒者为阳性细胞。

图1 大鼠长春瑞滨外渗性损伤组织的理想实验模型(大鼠右侧)

2.4 VEGF的表达 采用免疫组化标记和图像分析法。在电子显微镜下，观察VEGF的表达情况，分别在皮下组织、真皮及表皮三处高倍(×100)下各取3个视野，应用Image Pro Plus 5.0专业分析软件测出阳性细胞的积分光密度(integrated oPtical density，IOD)并取均值。

2.5 统计学方法 所得数据应用SPSS 17.0软件包处理，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

硫酸镁组、复脉膏组2组损伤组织中不同时间点VEGF积分光密度IOD的表达情况及组内、组间的比较。(见表1、图5)

实验发现：VEGF阳性表达主要见于增生的成纤维细胞胞浆、渗出的巨噬细胞、毛囊上皮细胞胞浆、血管内皮细胞、表皮细胞。根据表1、图5，可知：各组VEGF的IOD值在损伤后第1天就开始升高，其中硫酸镁组及复脉膏组左侧均在第4天升高明显，第7天升到高峰(见图2、3)，但复脉膏组左侧VEGF的IOD值明显高于硫酸镁组左侧，并且在第11天后才开始降低，持续时间较硫酸镁组长；硫酸镁组及复脉膏组右侧均在第4天升到高峰(见图4)，第7天即开始下降，其高峰值较2组左侧均低。

图2 复脉膏组左侧d7(VEGF×100)

图3 硫酸镁组左侧d7(VEGF×100)

图4 复脉膏组右侧d4(VEGF×100)

组别左侧IOD 右侧IOD P值硫酸镁组D1192.44±11.91186.94±9.79P=0.237>0.05D4311.34±14.79329.74±10.77D7343.11±10.72296.00±14.00D11269.77±8.88254.56±11.58D14197.27±12.41178.48±11.64D18144.69±10.79141.83±8.34复脉膏组D1210.26±14.43184.44±10.49P=0.006<0.01D4490.88±12.45334.74±12.18D7527.84±16.62292.50±11.88D11485.94±11.10247.06±8.93D14326.23±11.30173.54±7.35D18251.49±8.81144.84±9.76P=0.005<0.01P=0.415>0.05

图5 2组不同时间点VEGF积光分密度IOD线形图

由表1可知：硫酸镁组损伤组织中左侧与右侧不同时间点VEGF积分光密度IOD值比较，经配对t检验，P>0.05，无统计学意义，提示：50%硫酸镁湿敷未能明显刺激损伤组织中VEGF的IOD值升高；而复脉膏组损伤组织中左侧与右侧不同时间点VEGF积分光密度IOD值比较，经配对t检验，P<0.01，差异有统计学意义，提示：复脉膏外敷能明显刺激损伤组织中VEGF的IOD值升高。

由图5可知：2组右侧损伤组织中不同时间点VEGF的IOD值曲线近乎重合，经配对t检验，P>0.05，差异无统计学意义，说明：本实验可重复；硫酸镁组左侧与复脉膏组左侧损伤组织中不同时间点VEGF积分光密度IOD值比较，经配对t检验，P<0.01，差异有统计学意义，说明：复脉膏外敷较50%硫酸镁湿敷能明显刺激损伤组织中VEGF的IOD值升高。因此，复脉膏外敷较生理盐水外涂及50%硫酸镁湿敷更能刺激外渗性损伤组织中VEGF的阳性表达。

4 讨论

长春瑞滨为一种半合成长春碱类化合物，其抗肿瘤机制为阻滞微管蛋白聚合成微管并诱导微管解聚，干扰细胞有丝分裂达到抗肿瘤作用，属于细胞周期特异性药物[6]。长春瑞滨具有高渗透性，可透过血管渗入皮下组织间隙，可直接刺激神经末梢，同时药物刺激可引起局部炎症性反应，引起患者剧烈疼痛；能破坏细胞膜内外的渗透压平衡，使pH值改变而引起静脉炎或毛细血管痉挛，局部供血减少导致组织缺血、缺氧，局部出现水泡，形成硬结和溃疡[7]。长春瑞滨是治疗晚期非小细胞肺癌的有效药物之一，因药物价格比较低廉，尤适用于经济较不富裕的老年患者单药化疗。长春瑞滨联合顺铂也是晚期非小细胞肺癌最有效的联合化疗方案之一，适用于一般状况较好的患者。长春瑞滨对乳腺癌、食管癌、头颈部癌及淋巴瘤有效，与其他化疗药物联合使用广泛用于这些晚期肿瘤的化疗[8]。

我院著名肿瘤专家、全国名老中医药专家传承指导老师赵景芳教授，肿瘤科科主任、全国劳模尤建良教授，总结自己20余年的临床实践和临床经验，认为：化疗性静脉炎当属中医“恶脉”“脉痹”等范畴，是因药石攻伐，伤及脉络，热、湿、毒邪外侵，气滞血瘀，脉络不通，终致热、瘀、湿三者搏结脉道，外聚肌肤，进而红、肿、热、痛诸症丛生。治则当以清热解毒、活血化瘀、祛湿散结、通络止痛、扶正祛邪为大法。根据这些认识，创立中药制剂“复脉膏”，并形成稳定的院内自制制剂。

复脉膏由生大黄、野菊花、三棱、莪术、丹参、乳香、没药、党参、冰片组成。其中，生大黄清热解毒，活血祛瘀，泻下攻积，清热利湿，达到祛瘀生新之功效，是为君药；野菊花清热解毒，三棱、莪术破血逐瘀、行气消积、止痛，共为臣药，辅助君药以清热解毒、活血祛瘀、消结止痛；丹参活血化瘀，凉血消痈，乳香、没药活血止痛，消肿生肌，共为佐药，佐助君药以清热解毒、活血祛瘀、祛湿消结，通络止痛；党参益气、生津、养血，亦为佐药，佐助君药以扶正助祛邪；冰片清热解毒，消肿止痛，性善走窜开窍，无往不达，是为使药[9]。

现代药理研究表明[9-11]：生大黄、莪术、野菊花、没药、乳香、丹参、冰片均具有一定程度的抗炎、抗菌作用；生大黄、丹参、三棱、莪术均可改善微循环、抑制血小板、抗血栓形成；丹参、三棱、乳香、冰片、没药有止痛作用；党参、莪术有增强机体免疫功能的作用。

血管内皮因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一种促血管生长因子，广泛存在于组织细胞中，有很强的促血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells，VEC)增殖、促新生血管生长的功能。VEGF在生理和病理条件下均有表达。生理条件下，很多正常组织中都有表达，但表达水平一般较低。病理条件下，如肿瘤、损伤愈合等疾病中过量表达[12-15]。

VEGF的作用[12-15]：1)促VEC增殖：这是VEGF的主要作用。VEGF是一种VEC特异性促丝裂原，具有强烈的促VEC增殖作用。特别是当VEC损伤时，VEGF能促进损伤VEC迅速增生，减轻损伤VEC的功能阻碍，促进新生血管形成，加速创伤愈合。2)间接地阻止血管平滑肌的增殖与迁移：对防止血管再狭窄有重要意义。3)增加血管通透性：VEGF能极强地增加血管的通透性。4)抗血栓形成：VEGF可促进VEC的愈合，间接的抗血管内血栓的形成。5)其他：VEGF能激活单核细胞，并促进其迁移，这对组织炎症、血管新生、组织重构等均有重要作用。

VEGF是一种以血管内皮细胞为作用靶点的多功能细胞因子[12-15]，研究认为VEGF通过促进表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，而密切参与创伤的修复过程；创伤是VEGF表达的一个重要诱因，VEGF的高表达能促进创伤的愈合[16]。

本实验研究发现，VEGF在成纤维细胞胞浆、渗出的巨噬细胞、毛囊上皮细胞胞浆、血管内皮细胞、表皮细胞等均有表达。复脉膏外敷损伤组织中VEGF的表达要高于50%硫酸镁湿敷及生理盐水外涂，同时观察到2组各侧不同时间点的平均皮损面积提示：复脉膏外敷较50%硫酸镁湿敷及生理盐水外涂能明显减小各时间点的平均皮损面积。

综上可知，复脉膏外敷于损伤皮肤后能上调损伤组织中VEGF的表达，通过VEGF的生物学功能，进而促进损伤组织的愈合。因此，复脉膏可以用于防治化疗性静脉炎。

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(2014-04-13收稿 责任编辑：曹柏)

Effects of Fumai Paste on VEGF of Tissue in Vinorelbine- induced Extravasation Injury Model Rats

Zhou Liuyong，You Jianliang，Shan Zhenzhu,Zhang Chencen,Gong Shixia

(OncologyDepartment,WuxiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuxi214071,China)

Objective:To establish an ideal animal experiment model of vinorelbine-induced extravasation injury to study effects of Fumai Paste on VEGF of tissue,and explore the curative effect and mechanism of treating chemotherapeutic phlebitis with external application of Fumai Paste.Methods:Forty-two rats were randomly divided into two groups with 21 rats in each group.Each rat was established to experimental model.Rats in Fumai Paste group were treated with external application of Fumai Paste on left side; and rats in magnesium sulfate groiup were treated with hydropathic compress of 50% magnesium sulfate on left side.The right side of rats in both groups were treated with hydropathic compress of normal saline.Three rats were selected randomly from each group on day 1,day 4,day 7,day 11,day 14 and day 18,and the skin and subcutaneous tissue of extravasation injury of each rat was cut off.All specimens were fixed in formalin,dehydrated,embedded in paraffin and serially cut.All specimens were observed expressions of VEGF under the electron microscope by immunohistochemical assay and image analysis method.Results:The positive expression of VEGF was major in epidermic cells,vascular endothelial cell,endochylema of hair follicle cells,macrophage,endochylema of fibroblast.Fumai Paste could stimulate the positive expression of VEGF tissue of animal experiment model with vinorelbine-induced extravasation injury more than 50% magnesium sulfate and normal saline (P<0.01).Conclusion:Fumai Paste can up-regulate the expression of VEGF tissue of animal experiment model with vinorelbine-induced extravasation injury.With the biological function of VEGF,Fumai Paste can accelerate the healing of the damaged tissues.Hence,chemotherapeutic phlebitis can be prevented and treated with external application of Fumai Paste.

Fumai Paste; Vinorelbine; Extravasation injury; VEGF (vascular endothelial growth factor)

无锡市科学技术局科技支撑-社会发展项目(编号：CSE01019)

周留勇(1978.1—)，男，江苏省如皋市人，副主任中医师，硕士研究生，现工作于无锡市中医医院肿瘤科，主要从事恶性肿瘤的中西医结合治疗研究，E-mail：zhou-liuyong@163.com

尤建良(1963.2—)，男，江苏省无锡市人，主任中医师，南京中医药大学教授、硕士生导师，无锡市中医医院肿瘤科主任，主要从事恶性肿瘤的中西医结合治疗研究，E-mail：YJL1104@21cn.com

R332;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.020