人参总皂苷对野百合碱诱导的大鼠右室肥厚及ERK通路的影响

秦 娜 魏立伟

(河南省洛阳正骨医院，洛阳，471000)

人参总皂苷对野百合碱诱导的大鼠右室肥厚及ERK通路的影响

秦 娜 魏立伟

(河南省洛阳正骨医院，洛阳，471000)

目的:观察人参总皂苷(Total Ginsenosides，TG)对野百合碱(Monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室肥厚的影响并探讨其与细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的关系。方法:雄性SD大鼠随机分为正常对照组，MCT模型组，TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)剂量组，各组动物均给药18 d。测定各组大鼠的右室肥厚指数(RVHI)、右心重/体重(RVW/BW);透射电镜观察心肌细胞超微结构的改变;Real time RT-PCR检测心肌组织ERK1mRNA的表达，Western blotting检测心肌组MKP-1蛋白质的表达。结果:TG预防给药均使RVHI、RV/BW表达明显降低，改善超微结构损伤，降低心肌组织ERK1mRNA和提高MKP-1蛋白质的表达。结论:TG能明显改善MCT诱导的大鼠右心室肥厚，其抗心肌肥厚作用至少与抑制ERK1信号转导通路有关。

人参总皂苷;右室肥厚;细胞外信号调节激酶;丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1

心肌肥厚是心肌对多种心血管刺激的适应性反应，早期有一定代偿意义。但长期的心肌肥厚将发展为心力衰竭、心律失常和猝死[1]。右室肥厚、右心力衰竭是肺动脉高压死亡的主要原因[2]。因此，逆转右室肥厚是提高患者生存率和生存质量的重要环节。

人参主要活性物质人参皂苷有阻滞钙离子通道[3-4]、抗血管平滑肌细胞增殖[5-6]、调节一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的释放[7-8]等作用。我们以前的研究表明，人参皂苷Rb1和Rg1能显著对抗大鼠心肌肥厚的作用，其机制可能与抑制钙调神经磷酸酶和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)信号通路有关[9-10]，人参总皂苷的各单体间结构相似，推测若干成分可能具有类似单体的抗心肌肥厚作用，而且人参总皂苷相对便宜，来源丰富，更易于开发利用，本研究拟探讨人参总皂苷(Total Ginsenosides，TG)对MCT诱导的大鼠右心室肥厚作用，为传统中药人参的开发利用提供基础药理学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清洁级，体重(200±20) g。由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供(许可证号:SCXK20020003)。

1.1.2 试剂与材料 TG由北京天然药物研究院赵锐教授惠赠(用JTY-300型反相制备色谱固定相分离，纯度>93%)。MCT(批号:106K1602，美国Sigma公司);ERK1、β-action和逆转录试剂盒由大连宝生物工程有限公司;SYBR® GREEN PCRMaster Mix(ABI公司)。

1.1.3 实验仪器 实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司);逆转录(仪德国Eppendorf公司)，Model 550型酶标仪(美国BIO-Tek公司);Icycler荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)

1.2 实验方法

1.2.1 MCT模型制备及实验分组 实验大鼠随机分成正常组对照、MCT模型组、TG低、中、高剂量组，每组10只。除正常对照组外其他各组单次腹腔注射(i.p.)2%MCT 60 mg/kg，24 h后TG低、中、高剂量组分别腹腔注射TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)，给药共18 d。

1.2.2 右室肥厚指数测定 称右室(RV)和左室及室间隔(LV+S)的重量，计算右心肥厚指数，即RVHI=RV/(LV+S)以及RV/BW。

1.2.3 右心肌组织超微结构的观察 取新鲜右心室组织约1 mm3，电镜液中固定，环氧树脂包埋，铀铅双染色，超薄(600A)切片，日立H-600型透射电镜观察各组标本细胞核、细胞器、线粒体等超微结构的变化。

1.2.4 Real-Time RT-PCR检测心肌组织ERK1mRNA的表达 右心肌组织总RNA的提取及逆转录操作按试剂盒说明进行。以PCR仪逆转录后，RT-PCR仪进行扩增。β-actin引物:正向5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'，反向5'-TAGAGCCACCAATCCACACA-3'，扩增产物长度104 bp，ERK1引物正向5'-GTTCCCAAACGCTGACTCCAA-3'，反向5'-GTAAGTCGTCCAGCTCCA

TGTCAA-3'，扩增产物长度182 bp，PCR反应条件:95 ℃，10 min进入循环;95 ℃，15 s、60 ℃，1 min，循环45次。以β-actin为内参，用相对定量法计算ERK1 mRNA的表达水平。以循环阈值(Ct值)为统计参数，用目的基因表达/β-actin基因表达对ERK1 mRNA进行相对定量。

1.2.5 Western blotting检测心肌组织中MKP-1蛋白表达 右心室组织约100 mg经T-PERTM蛋白提取混合液处理后，取上清液用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量。以10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电压36 V，3 h电转。封闭、分别加MKP-1一抗(1∶400)及内参anti-β-actin(1∶2 000)，孵育2 h;二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，孵育1 h后通过BCIP/NBT进行显色，采用Syngene凝胶成像系统分析。

2 结果

2.1 大鼠一般状态的变化 正常对照组在用药前后一般状态无明显差异，BW18 d较前增加了36%，MCT模型组大鼠在腹腔注射MCT 7 d出现活动明显减少，毛发直立，口唇发绀，呼吸急促，食欲下降。18 d处死开胸，可见肺表面凹凸不平，弹性差，并可见灶性瘀血;BW较前增加了2%，TG各预防给药组一般状态较MCT模型组明显好转(见图1)。

图1 TG40 mg/kg预防给药对大鼠体重的影响

2.2 TG对右心室肥厚指数的影响 与空白对照组比较，MCT模型组在腹腔注射MCT18 dRVHI、RVW/BW分别增加了30%、44%，TG各预防给药组与MCT模型组比较，上述指标明显降低(P<0.01)，但TG各剂量组之间无统计学意义。(见表1)

表1 TG预防给药对野百合碱诱导心肌肥厚大鼠肥厚指标的影响

注:与对照组比较，##P<0.01；与MCT组比较，**P<0.01。

2.3 TG对心肌肥厚大鼠心肌超微结构的影响 正常大鼠的超微结构无异常表现(C)，MCT模型组大鼠心肌组织出现闰盘中断，肌丝稀疏，灶性溶解，并出现空白水肿，收缩带形成;线粒体增生，肿胀变形，嵴排列紊乱、溶解，巨线粒体形成;细胞核增大，核周间隙增宽，核仁增多(M)。TG40、60 mg/(kg·d)预防给药18 d上述变化明显改善，肌丝排列尚可，线粒体轻度肥大，基质水肿不明显，未见闰盘中断和空白水肿，但线粒体仍然明显增生(M〞、H)。(见图2)

2.4 Real time RT-PCR检测ERK1mRNA的表达

RT-PCR检测结果显示，正常对照组大鼠RV中ERK1mRNA表达较低。MCT促进ERK1mRNA的表达明显增加，与正常对照组比较，ERK1mRNA增加了2.6倍(P<0.01)。TG预防给药均明显抑制ERK1mRNA的表达，与MCT模型组比较，TG 20 mg/kg使ERK1mRNA的表达减少29.3%(P<0.01)，各剂量组间差异无统计学意义。(见图3)

图2 TG预防给药对心肌细胞超微结构的影响

图3 TG预防给药对MCT诱导心肌肥厚大鼠RV中ERK1mRNA表达的影响

2.5 TG预防给药对MCT诱导心肌肥厚大鼠RV中MKP-1蛋白质的影响 Western blotting实验结果表明，与正常对照组比较，MCT模型组MKP-1蛋白的表达稍有增高，TG预防给药能使提高MKP-1蛋白的表达，与MCT模型组比较，低、中、高剂量组分别增加了11%、81%、190%，但仅有中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。(见图4、图5)

3 讨论

目前，心肌肥厚发展为心力衰竭在各种心血管病症中死亡率占居首位[11]。故对其预防和治疗的研究显得尤为重要。本实验利用大鼠MCT右室肥厚模型，观察了TG对心肌肥厚的作用并分析其可能的作用机制。

MCT右室肥厚模型被广泛用于非原发于心脏的右心室肥厚和心力衰竭研究[12]。本实验结果表明，大鼠在单次腹腔注射MCT 18 d后，RVHI、RVW/BW均明显高于正常对照组，说明MCT右室肥厚的模型制备成功，TG预防给药组能明显减轻上述指标的增高，其中，由于模型组给药前后BW无差别甚至略低，与相应正常对照组比较明显偏轻，RV/BW可能因模型组体重减轻而产生一定的非特异效应，但RVHI的明显升高强烈提示RVH的发生。单从检测指标上看，TG高剂量给药组比低剂量效果更为明显，然统计学分析表明，各剂量组间无明显差异。另外，心肌组织透射电镜结果显示模型组心肌组织出现了心肌肥厚的病理改变，而TG能明显改善MCT所引起的心肌超微结构的损伤，提示TG对右室的心肌线粒体具有保护作用。以上结果提示TG具有减轻MCT引起心肌肥厚的作用。

图4 Western blot检测各组大鼠右心室MKP-1蛋白质表达

注:A为正常对照组，B为模型组，C为TG低剂量组，D为TG中剂量组，E为TG高剂量组

图5 TG对野百合碱诱导大鼠右心室MKP-1蛋白质表达变化的影响

结合以上实验结果，本研究进一步探讨了TG预防心肌肥厚可能的作用机制。MAPK是调节心肌肥厚的重要信号通路，被认为是多种细胞外信号引起细胞增生、肥大的细胞内信息传递的汇聚点或共同通路，MAPK其成员ERKs与细胞生长、分化和增殖的调控关系最为密切，参与多种刺激引起的心肌肥大[13]。活化的MAPK主要因被其磷酸酶去磷酸化而失活，在心肌细胞，MKP-1是重要的MAPK磷酸酶，对MAPK的活性调节具有重要意义[14]。另有研究表明，许多人参皂苷单体(Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg3)均能降低TPA诱导的ERK1/2的激活，降低ERK1/2蛋白表达水平[15-16]。本研究发现，MCT模型组ERK1mRNA水平表达显著增高，MKP-1蛋白水平稍有增高，与正常对照组比较无统计学意义，TG低、中、高预防给药都能降低ERK1mRNA的表达，同时提高MKP-1蛋白表达水平，从而增加对ERK1的灭活，延缓心肌肥厚的发展进程。需要指出的是，TG对ERK1mRNA表达的影响各个剂量组之间差异无统计学意义，但对MKP-1蛋白水平的影响各个剂量组之间差异有统计学意义，能剂量依赖性提高蛋白的表达，其原因可能是本实验所用ERK1的引物不是针对其活性部分的;机体对ERK1活性的调节发生在蛋白水平。TG抗心肌肥厚的作用至少与调控MAPK信号通路有关。

心肌肥厚的发生发展是一个多因素参与的复杂的病理生理过程，TG抗心肌肥厚的作用除影响MAPK信号通路外，还可能与其他信号通路有关，值得进一步研究。

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(2014-04-24收稿 责任编辑：王明)

Effects of Total Ginsenosides on Monocrotaline-induced Cardiac Hypertrophy and ERK Signaling Pathway in Rats

Qin Na,Wei Liwei

(LuoyangOrthopedicsTraumatologicalHospital,Luoyang471000,China)

Objective:To investigate the inhibition of total ginsenosides (TG) on right ventricular hypertrophy induced by monocrotaline(MCT) and explore the effects of TG on extracellular-regulated kinase(ERK) signal transduction in rat.Methods:Male Sprague Dawley rats were randomly divided into the normal group,MCT group and 20 mg/(kg·d),40 mg/(kg·d),60 mg/(kg·d) dose TG treatment group.Ventricular hypertrophy index(RVHI) was measured by the weight ratio of RV to left ventricle plus septum,and by observing the ultrastructural changes of myocardial cell with transmission electron microscope.The ERK1 mRNA and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1) protein expression of right ventricle tissue were detected by real-time RT-PCR,Western blotting.Results:TG treatment could significantly reduce RVHI,RVW/BW.The swollen and misshapen mitochondria could be improved by TG.TG also could down-regulate ERK1 mRNA expression and enhance MKP-1 protein expression.Conclusion:TG could significantly attenuate MCT-induced cardiac hypertrophy in rat by suppressing ERK Signaling pathway.

Total ginsenosides; Right ventricular hypertrophy; Extracellular-regulated kinase; Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.023