糖尿病肾病动物模型的研究进展

李 懿，张立颖

糖尿病肾病（DN）是糖尿病慢性微血管并发症之一，以肾小球血管损伤、硬化为主，形成结节性病变，进而出现肾功能异常，最终形成终末期肾病（ESRD）。在西方国家人群中，DN已经成为终末期肾衰竭的主要原因，也是糖尿病致死的主要原因［1］。随着糖尿病的不断流行，我国DN的发病率也呈增多趋势，DN防治已经成为一个不容忽视的问题。但由于确切的发病机制尚未阐明，建立合适的模型是研究其发病机制、病理变化的重要线索。同时也为临床防治该疾病提供依据。目前，DN动物模型的常见制备方法包括手术切除胰腺、化学药物诱导、自发性形成、转基因技术等，但由于手术切除胰腺后的动物常在还未出现并发症时就死于糖尿病本身，所以本研究主要对后面几种方法进行阐述。

1 诱发性DN动物模型

通过各种技术手段损伤动物的胰脏或胰岛B细胞导致胰岛素缺乏，或用各种拮抗剂对抗胰岛素的作用，引起实验性糖尿病或高血糖，而持续性高血糖是发生DN的必要条件。

1.1 1 型糖尿病肾病模型制备 DN 动物模型的诱发药物包括链脲佐菌素（STZ）、四氧嘧啶（ALX）、链脲佐菌素联合弗氏完全佐剂以及四氧嘧啶加嘌呤霉素等。常用的是STZ、ALX。STZ通过选择性杀伤动物胰岛B细胞，使其丧失分泌功能，形成不可逆的胰岛素依赖性糖尿病，随病程的延长可发展为DN［2］。采用STZ诱导的1型糖尿病模型动物，可出现中等程度的蛋白尿、血肌酐升高和与DN相关的病理改变。由于STZ造模稳定、快速，种属选择性不强，复制前不需禁食，组织毒性较小等，故常用STZ诱导构建1型糖尿病小鼠模型，技术已基本成熟，得到了广泛应用［3］。

1.1.1 高剂量STZ诱导的小鼠糖尿病肾病模型 一次性给予实验动物≥200mg/kg的STZ腹腔注射，增大胰岛B细胞毒性，导致糖尿病发生率增高和严重程度加剧。由于严重的高血糖，需要对血糖浓度和胰岛素给药情况进行监测。几个月后，可以检测到中等程度蛋白尿和肾小球硬化。但是，由于STZ对其他组织也有非特异性毒性作用，因此很难将STZ直接毒性作用与高血糖病变加以区分。一些研究表明，该模型中蛋白尿严重程度与STZ剂量有关，而不依赖于血糖水平［4］。此外，高剂量STZ引起小鼠急性肾损伤已有报道［5］。

1.1.2 低剂量STZ诱导的小鼠糖尿病肾病模型 为了减轻STZ非特异性细胞毒性，人们采用低剂量（40 mg/kg～55mg/kg）STZ多次注射诱导糖尿病。该方法一般是40mg/kg～50mg/kg STZ腹腔注射，每天1次，连续5d［6，7］。低剂量STZ多次注射可导致胰腺B细胞低程度地反复损伤，同时伴有胰岛内淋巴细胞浸润。以更小剂量STZ，如30mg/kg多次腹腔注射诱导的动物模型被认为同1型糖尿病更接近［8］。Gurley等［9］报道小鼠品系对低剂量STZ多次诱导的糖尿病易感性顺序为DBA＞C57BL/6＞MRL/MP＞129/SvEv＞BALB/c。研究也表明，雄性小鼠较雌性小鼠对STZ更敏感。不同近交系小鼠对低剂量STZ的B细胞毒性和非特异性毒性作用的敏感性存在很大差异，造模时可调整剂量。一般情况下，对同一品系，采用适当的低剂量STZ多次诱导与高剂量STZ一次诱导可产生相似的高血糖，但蛋白尿的程度一般较低［10］，可能反映了直接肾毒性降低。美国糖尿病并发症动物模型协会（AMDCC）还建议采用一个标准的低剂量模型诱导糖尿病并发症包括DN。根据这一建议，作为DN动物模型的小鼠应该连续5d，每天腹腔注射STZ 50mg/kg，然而仅有50%C57BL/6小鼠发展为显性糖尿病。因此，该方法是否被相关专家采纳还值得商榷。

1.1.3 STZ诱导的大鼠DN模型 大鼠DN模型一般在斯泼雷格·多雷（Sparague Dawley，SD）、威斯塔·京都（Wistar Kyoto，WKY）和自发性高血压大鼠（Spontaneous Hypertension Rat，SHR）大鼠中诱导。8周龄雄性大鼠（200g～250g）禁食16h，一次性尾静脉注射（SD 55mg/kg，WKY 60mg/kg，SHR 45mg/kg）饮用蔗糖水（15g/L）48h［11］，以减少早期死亡（因为贮存的胰岛素从受损的胰岛中大量释放导致低血糖）。注射后1周，测定空腹血糖15mmol/L以上者（约有90%）纳入DN研究。为防止随后发生酮尿，糖尿病大鼠每天需皮下注射长效胰岛素（2U/鼠～4U/鼠）以维持理想的血糖水平（16mmol/L～33mmol/L）。STZ注射后至少3周，肾脏才能从STZ轻微的急性肾毒性中恢复过来，这时才能开始检查STZ诱发DN的作用［12］。42d后大鼠尿微量白蛋白水平升高，肾脏膜细胞增生、基质增多、肾小球基底膜增厚。

1.1.4 单侧肾切除后诱导的大鼠DN模型 不同品系的大鼠（SD，Wistar和SHR）单侧肾脏切除术加上35mg/kg～50mg/kg STZ多次小剂量诱导即可制备模型。单侧肾切除后可导致对侧肾的代偿性肥大并加速疾病的进展过程。

1.2 2型糖尿病肾病模型

1.2.1 大鼠2型糖尿病肾病模型 采用SD大鼠喂以高糖高脂饲料（饲料组成：10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料），以诱导出胰岛素抵抗。联合40mg/kg的STZ腹腔注射［13］破坏胰岛B细胞的部分功能，使胰岛素分泌减少，形成非胰岛素依赖性2型糖尿病。此方法模拟人类2型糖尿病形成过程，后期形成DN模型。21d后血糖稳定升高，98d后模型大鼠出现与临床DN相似的生化、尿液、病理组织学、免疫组织化学变化［14］。

1.2.2 小鼠2型糖尿病肾病模型 给C57BL/6小鼠喂饲高脂饲料（10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料）是诱导肥胖和胰岛素抵抗2型糖尿病的一种常用方法。该法对研究动脉硬化尤其有用。高脂饲料的作用与研究的小鼠品系有关，APJ小鼠相对抵抗［15］，该模型中蛋白尿未有报道。一项研究发现高脂饲料可在KK－ay小鼠诱导明显的蛋白尿［16］。

2 自发性DN动物模型

该模型是指动物未经过任何有意识的人工处置，在自然情况下发生的DN，或者由于基因突变，染色体畸变，通过定向培育保留下来的动物模型，进而发生DN。这类动物模型特点是来源有限，繁殖饲养条件要求高，发病率低，造模周期较长，价格昂贵，但在一定程度上减少了人为的因素，肾脏病变特点与人类DN相似程度较高，此类动物模型为糖尿病及其并发症机制及药效学研究提供了实验平台。

2.1 1型糖尿病肾病自发性动物模型

2.1.1 NOD（nonobese diabetic mouse）小鼠 NOD小鼠是目前研究最广泛的1型糖尿病肾病自发性动物模型。由于与人类DN的致病性和遗传的相似性，该模型广泛用于对病因、病理和疾病相似性的探讨。NOD小鼠是ICR近交系小鼠，大概在4周龄～5周龄起，小鼠胰腺自发出现程度不等的炎症，24周龄～30周龄时大多数胰腺B细胞被破坏出现显性糖尿病，进而发展成为DN，表现为尿蛋白排泄增加。肾脏病理变化：系膜细胞增生，肾小球毛细血管基底膜增厚，细胞外基质增多，最后出现肾小球硬化［17］。在NOD小鼠中，雌鼠的发病率比雄鼠高4倍［4］。该模型与人类1型糖尿病在临床症状上有众多相似之处：高血糖、尿糖、多尿、多饮，不仅有如此相似之处，还包括含有特异性主要组织相容性复合体（MHC）ò类等位基因和许多非MHC位点作为多基因易感性位点；通过造血干细胞传播疾病；胰岛内炎性细胞浸润（胰腺炎）；有胰岛自身抗体；对T细胞严重依赖［18］。然而它对酮症酸中毒的抵抗性更强。如果没有胰岛素的注射，NOD小鼠通常死于脱水而非酮症酸中毒。尽管如此，NOD小鼠仍然不是一个完美的动物模型，作为一个近交系，存在着可以发展为1型糖尿病的风险并且以一种可以预见的方式发展［19］。而人类的1型糖尿病肾病是一个多基因遗传病，并且受到环境的影响。

2.1.2 胰岛素－2Akita小鼠 因为Insulin－2基因突变，导致胰岛素肽链错误折叠，选择性地对胰岛B细胞产生蛋白毒性，导致B细胞分泌胰岛素能力下降。突变的杂合子在（3～4）周龄时由于严重的胰岛素缺乏表现为显著的高血糖，但纯合子通常在围生期死亡。雄性小鼠比雌性小鼠更缺乏胰岛素。Akita小鼠表现出一定程度的蛋白尿和轻至中度的肾小球系膜扩张。DN早期即可表现为足细胞缺失，可能与足细胞凋亡增加有关［20］。Akita小鼠模型可以出现病理结构表现，如肾小球系膜扩张，足细胞数目减少，肾小球硬化，肾间质纤维化等［21］。此外，Akita小鼠可产生不明原因的IgA系膜沉积，这就使得关于肾小球系膜增生的解释变得更加复杂［22］。目前，这种突变的小鼠种系中只有C57BL/6可以利用，但C57BL/6小鼠对DN有较好的耐受性，因此不是理想的DN模型。

2.2 2型糖尿病肾病自发模型

2.2.1 db/db小鼠 db/db小鼠是位于小鼠4号染色体的瘦素受体因突变所致的先天肥胖性2型糖尿病模型。db/db小鼠发生糖尿病的病程与人类极为相似，微血管并发症多见，尤其好发DN。在出生10d后就表现出高胰岛素血症，1个月后表现出轻度的血糖升高，8周龄后表现为显著的高血糖［10］。12周～14周出现明显的组织形态学改变，表现为肾小球肥大，系膜区增宽，基底膜增厚，细胞外基质过量积聚，肾功能明显损害［23］。在db/db小鼠中蛋白尿水平为68μg/24h～600μg/24h［10，24－27］。一般来说，这些小鼠不会发展到肾小球膜溶解、结节性肾小球硬化和进行性肾功能不全［28］。对于人类早期的DN研究而言，不失为一个好的选择。

2.2.2 GK大鼠 GK大鼠是由对葡萄糖不耐受的Wistar大鼠重复近亲繁殖多代后产生。这种动物模型的特点是中度的高血糖，外周胰岛素抵抗和肥胖表型。GK大鼠产生2型糖尿病肾病主要由于胰岛B细胞受损。GK大鼠表现出与人类早期DN一致的肾小球肥大、基底膜增厚等。在出生8个月后也不表现出明显的蛋白尿和进行性肾病。然而，Sato等［29］发现GK大鼠在24月龄时表现出节段性肾小球硬化和肾小管间质纤维化等晚期肾脏病变。与此同时，出现了显著的蛋白尿。因此，他们认为晚期DN大鼠的肾脏变化与人类进行性DN相似，GK大鼠可以作为研究DN及2型糖尿病的有用工具。

2.2.3 OLETF大鼠 OLEFTF大鼠是胆囊收缩素（CCK）2A受体信使RNA（mRNA）的表达完全缺失的2型糖尿病大鼠。早期以胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱为主，以后逐渐出现胰腺功能减退，胰岛纤维化，晚期合并DN［30］。可以采取锻炼和限制高热量饮食的摄入作为OLEFT大鼠在2型糖尿病肾病的进展过程中的预防措施。12周龄～20周龄时表现出轻度的肥胖和高胰岛素血症，18周龄时表现出与晚发性高血糖［31］，22周龄时出现大量显性蛋白尿、30周龄时、OLETF大鼠肾脏膜基质增生，基底膜增厚，肾小球透明性变、缩小，出现结节性肾小球硬化［32］，54周龄时表现出与人类DN相类似的大量蛋白尿、结节性病变、弥漫性肾小球硬化和肾小管间质纤维化［33］。因此，OLEFT被视为研究DN最好的鼠类动物模型之一。

2.2.4 ob/ob小鼠 ob/ob小鼠糖尿病的发生是由于ob基因突变，造成其编码的蛋白瘦素缺乏，引起肝脂肪生成和肝糖原异生显著增加，高血糖又刺激胰岛素分泌，导致胰岛素抵抗。这种突变主要存在于DBA2/J和B57BL/6J品系小鼠。ob/ob小鼠症状的轻重取决于遗传背景，纯合子动物表现为肥胖、明显的高血糖及高胰岛素血症，而ob/ob/6J小鼠胰岛素水平可达正常小鼠10倍～50倍，但其血糖常只有轻度的升高。Clee等［34］将ob/ob变异引入到BTBR小鼠品系中。BTBRob/ob小鼠在第8周出现与人类DN早期形态学特征类似的早期肾脏改变，包括早期足细胞丧失及同时出现的蛋白尿。蛋白尿出现10周后可检测到系膜增厚，第18周时这些小鼠出现DN晚期的典型特征，如严重的系膜增厚、肾小球系膜溶解、持续性足细胞丢失、基底膜增厚、轻度间质纤维化。BTBRob/ob小鼠的一个突出优点是在相对较短时间就会发展到DN晚期，这就缩短了模型建立后对DN晚期进行干预的研究时间［35］。ob/ob小鼠与db/db小鼠比较，肾脏疾病更少，这可能是由于ob/ob小鼠缺乏循环的瘦素，而瘦素可以直接刺激间质产生。另外一种可能是两种小鼠的基因背景不同。Pichaiwong等［36］利用瘦素替代而不抑制肾素血管紧张素系统（RAAS），发现晚期DN动物模型的结构（肾小球系膜扩张、肾小球膜溶解、基底膜增厚、足细胞的损失）和功能（活性氧的积累、蛋白尿）几乎可以完全逆转，因此，BTBRob/ob小鼠提供了一个先进但可逆的动物模型，这些结果也表明了足细胞的恢复是可能的但不是由RAAS抑制引起的，可能解释了RAAS抑制剂在治疗DN上缓解的有限性，这一动物模型的缺点是价格昂贵，不能生育。

2.2.5 Zucker大鼠 Zucker大鼠体内编码瘦素受体的基因错义突变，表现出高血糖、高血脂、高血压。27周龄大鼠肾脏出现肾小球囊膜基质弥散或结节状的增生，基底膜增厚，近曲小管萎缩。Reisin等［37］采用Zucker大鼠高脂喂养的方法制作模型，大鼠体内蓄积大量胆固醇、脂肪酸，在体内发生脂质过氧化反应，产生细胞毒性，引起肾脏细胞凋亡和器官损坏。

3 基因工程糖尿病肾病动物模型

基因工程动物是指某种或某些遗传性状通过基因工程技术而被人为改造过的动物。利用转基因、基因敲除、基因替换等手段，可以用来研究DN相关遗传易感基因。通过这一技术，我们可以在动物基因组的特定位点引入所设计的突变基因，模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常；可以通过对基因结构进行修饰，在动物发生、发育的全过程中研究体内基因的功能及其结构功能之间的关系。

3.1 eNOS敲除鼠 敲除上皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidesynthase，eNOS）基因的 C57BLKS/J（BKS）db/db小鼠，表现为高血糖、高血压、蛋白尿。26周后其病理改变为肾小球系膜基质扩张、伴小动脉瘤的肾小球系膜溶解及Kimmelstiel－Wilson结节性改变。eNOS可以减少内皮细胞间连接，降低血管通透性，不含eNOS基因的小鼠更易形成DN损伤。eNOS基因敲除鼠在模拟糖尿病的晚期肾脏形态学变化，尤其是在有敏感的遗传背景小鼠是在很多糖尿病动物模型中很难见到，这意味着这种小鼠模型非常具有发展前景。或许当这种突变被转移到另外一种遗传背景上时和eNOS解剖位点的缺失可调节时一个更稳定的糖尿病动物模型可能会出现［35］。

3.2 转基因OVE26小鼠 利用转基因技术使钙调蛋白在OVE26自发性糖尿病小鼠胰岛B细胞中过量表达。小鼠2月龄时出现蛋白尿，6月龄时出现大量蛋白尿，9月龄时肾小球基底膜增厚，系膜扩张，出现肾小球硬化和小管间质性纤维化等病理改变，伴有肾小球滤过率降低［38］。

3.3 GIPR（dn）转基因小鼠 GIPR（dn）转基因小鼠是一种新型的早发性DN动物模型，病理现象与人类DN相似。通过随机诱变和基因修饰获得，使得葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体隐形表达，破坏B细胞，胰岛素分泌减少，形成DN。进而发展成为ESRD，这种小鼠对于单基因DN的发病机制和治疗方法的研究具有重要意义［39，40］。

4 小结

随着DN发生率的逐渐升高，建立一个理想的动物模型刻不容缓。但是，人类DN是一个发病机制非常复杂的并发症。由于实验动物与人的差异性，动物模型仅仅能模拟人类DN的病理学改变和部分功能性改变，不能完全重现人类DN。因此，DN动物模型的制备应该更加侧重于病因上的相似性，今后应该不断探索，努力开发出更多更好的DN动物模型用于医学研究中。

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