miRNA 与大肠癌关系的研究进展

(大连医科大学附属第一医院 消化科，辽宁 大连116011)

徐梦杳，刘丽娜，李春艳

大肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，严重影响人类健康。近年来，随着人们生活水平的提高及饮食习惯的改变，大肠癌在中国的发病率正在逐年攀升。大肠癌早期多无明显症状，许多患者在确诊时已是晚期，而大肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检出时间，早期诊断对于改善预后有重要作用。

目前大肠癌筛查的方法主要有粪便隐血试验和结肠镜检查。粪便隐血试验尽管减少了结肠癌相关的死亡率，却缺乏相应的敏感性和特异性［1］。结肠镜检查是大肠癌诊断的金标准，但因结肠镜为有创检查，病人不适反应多，依从性差，且费用高，故不能用作大范围筛查。寻找新的具有高敏感性和高特异性的肿瘤标记物对结肠癌的早期诊断和病情监测具有极其重要的意义。

大肠癌的发生是一个多因素、多阶段和多基因的改变协同作用的过程，癌基因和抑癌基因的表达失调是结肠癌发生的分子基础。微小RNAs (microRNAs 或miRNAs)是一类内源性小片段非编码的RNA 调控因子，可作为肿瘤抑制基因或癌基因参与肿瘤的发生、发展过程。近年来的研究显示，miRNA是有潜力的生物标志物［2］。越来越多的研究表明，miRNA 与肿瘤的发生、发展、诊断、转移有很大关系，miRNA 有望成为新的生物学标志物和治疗靶点。近年来，miRNA 与大肠癌的关系引起越来越多学者的关注，成为当前研究的热点。

1 miRNA 在大肠癌中的表达

研究发现，多种miRNAs 在大肠癌中表达。早在2003年，Michael 等［3］首先发现，miRNA 在大肠癌组织与正常结肠黏膜组织中的表达存在差异性，并明确miR-143 和miR -145 在大肠癌及癌前病变组织中的表达下调，表明它们或许是抑癌miRNA，抑癌miRNA 的缺失可能导致癌基因过度活跃，从而引起大肠癌的发生。Arndt 等［4］研究表明，与正常结肠黏膜组织相比，大肠癌有37 种miRNAs 具有差异性，其中一些miRNAs 的表达改变(包括miR-133a 表达缺失和miR-224 表达增加)与大肠癌的进展相关。另一研究发现，与正常对照组相比，大肠癌患者血清中有6 种miRNA(miR-18a、miR-19、miR -19b、miR -15b、miR -29a、miR -335)显著升高［5］。Bandrés 等［6］通过RT - PCR 技术对大肠癌和癌旁组织的156 个miRNA 的表达量进行了检测，确定了13 个异常表达的miRNA，其中最显著的包括miR -31、miR -96、miR -135b、miR -183、miR-133b、miR-145，前三者的表达无论在组织水平还是细胞水平均上调，后两者的表达下调。其中，miR-31 的表达水平还跟大肠癌的临床分期密切相关。后来的学者应用新的筛选工具发现了更多的miRNA，目前已发现有超过100 个miRNA 和大肠癌有关［7］。

2 miRNA 在大肠癌发生、发展中的作用

大肠癌的发生受到遗传和环境因素的作用，涉及癌基因的上调与抑癌基因的下调或失活，整个过程表现为多基因、多步骤的协同累积作用。鉴于miRNA 对基因表达的广泛影响，miRNA 与大肠癌的发生密切相关。大量研究表明，在癌组织中失调的miRNA 通过多种机制，包括染色体畸变，如扩增、缺失、易位［8］、表观遗传因素如DNA 甲基转移酶［9］、有缺陷的miRNA 加工机制［10］等，促成癌细胞异常的生物学行为，根据它们在恶性肿瘤发展中的角色，miRNA 在大肠癌中可能起着癌基因或抑癌基因的作用。

2.1 miRNA 参与大肠癌细胞的生长、凋亡

许多癌基因通过促进细胞增殖及G1期向S 期过渡、逃避凋亡等方式发挥作用。以这类基因为靶标的miRNA 在癌组织中通常上调，从而促进肿瘤的形成。如miRNA 家族miR-221/222 已经被证实为促癌基因，在大肠癌组织中表达明显上调，其靶标是细胞周期调节蛋白p27kip1［11］。而许多抑癌基因如miR-34 家族在结肠癌组织细胞中调控着下游靶标抗凋亡家族蛋白Bcl-2 的表达，Bcl-2 家族通过阻止线粒体细胞色素C 的释放而发挥抗凋亡作用。抑癌基因miR -34 下调引起抗凋亡Bcl -2 蛋白的过度表达，参与大肠癌的发生［12］。

2.2 miRNA 参与大肠癌侵袭与转移

侵袭与转移是肿瘤最显著的特点，同时也是一个复杂的过程，涉及多种癌基因、抑癌基因、黏附相关分子、信号转导基因、蛋白水解酶、细胞因子与调节因子等。目前研究发现，miRNA 通过以下机制参与大肠癌的侵袭与转移:(1)调节大肠癌细胞上皮间质转化(EMT)及黏附力。Kong 等［13］证实miR -155 的表达上调可增加肿瘤侵袭转移力，其机制可能是miR-155 在TGF-13/Smad4 信号通路中通过下调其靶基因RhoA 的表达，诱导EMT 的发生，促进大肠癌侵袭转移。(2)调控癌基因、抑癌基因及大肠癌转移基因的表达。研究发现，miR -21 与程序性死亡因子4 蛋白(PDCD4)基因在结肠癌组织中的表达呈负相关，其中PDCD4 蛋白的表达水平显著低于正常结肠黏膜组织［14］。这说明miR -21 可负向调控PDCD4 表达，从而导致大肠癌细胞侵袭、血管浸润和转移的发生。(3)调节大肠癌细胞DNA甲基化模式。如miR-342 靶向抑制DNA 甲基转移酶(DNMTl)的表达，抑制细胞增殖［15］。(4)调节大肠癌血管的生成。如miR -107 簇基因族可通过抑制低氧诱导因子的表达，间接促进血管内皮生长因子的表达，从而促进肿瘤血管的生成，导致大肠癌细胞发生侵袭与转移［16］。

3 miRNA 在大肠癌诊断中的作用

研究表明，除了在大肠癌组织中可检测到miRNA 表达外，患者的血浆或血清中也可检测到miRNA，miRNA 有可能成为新的肿瘤诊断候选分子标记物。源于肿瘤的miRNA 在血液中避开了内源性核糖核酸酶的活性，具有相当稳定的存在形式，这些肿瘤miRNA 可在福尔马林固定标本和患者的血液、体液标本中稳定表达，且目前包括荧光定量qRT -PCR 在内的检测手段使得miRNA 的检测方便易行。因此，miRNA 作为新的肿瘤标记物，对肿瘤的诊断将起到十分重要的作用［17］。

健康人血液中的100 多种miRNA 已得到确认，其表达谱与大肠癌患者的几种肿瘤特异性miRNA表达谱有明显的差异。有学者通过与健康对照组比较，发现大肠癌患者血浆miRNA17 -3p 和miRNA-92a 的表达水平显著升高，且这两种miRNAs 的水平在手术切除肿瘤组织后显著下降［18］，故其有望作为大肠癌患者诊断及术后监测指标。miR -29a 是大肠癌的另一诊断标志物，它被证实可以区别出正常对照组与大肠癌及腺瘤，敏感性分别为69% 和62.25%，特异性分别为89.1%和84.7%，进一步实验表明，与腺瘤组相比较，miR -29a 在大肠癌患者血浆中的水平显著提高，其表达与TNM 分期相关［19］。随着对miRNA 的深入研究，根据血液中检测的这种独特的miRNA 表达谱，可对具有中等或高风险的肠息肉患者进行监测，从而减少对高危患者行肠镜检查的频率。

有研究发现，大肠癌患者血清中存在69 种特异性miRNA;同时发现一组由14 种血清miRNA 组成的独特表达谱在大肠癌中表达，而在肺癌中未发现其表达［20］。每种肿瘤都有特异的miRNA 的表达谱，进一步说明其与肿瘤分类和复发预测的关系，但miRNA 仍具有多种肿瘤重叠表达的特点，故只依据单一的miRNA 还不足以做出精确诊断，仍需在血液方面建立与健康人年龄相匹配的miRNA 表达谱，根据这些特异的miRNA 表达谱，对大肠癌高风险患者进行监测与诊断。

4 miRNA 与大肠癌治疗反应的关系

miRNA 是内源性产生且具有对机体毒性小的特点，在临床治疗上有较好的应用前景。由于目前发现的miRNA 在肿瘤中表达存在上调与下调，应用miRNA 治疗肿瘤主要有两种策略:一类是针对于miRNA 表达上调的疾病，在治疗中需要目标miRNA与注射的互补RNA 序列相结合而失去活性、保持沉默，使疾病相关miRNA 下调;另一类是包括许多肿瘤在内的与miRNA 下调相关的疾病，在miRNA 类似物作用下使miRNA 上调，从而达到治疗的目的。

在大肠癌患者治疗中，对于那些上调的miRNA，目前公认的治疗方法是使miRNA 沉默，主要是应用miRNA 寡核苷酸(AMO)。在生理条件下，AMO 可以利用所具有的miRNA 的互补序列与miRNA 紧密结合，这种结合较稳定，不容易解离，从而可以有效地降低miRNA 的活性。

针对在肿瘤中下调的miRNA，转染pre -miRNA 以纠正miRNA 的表达下调，从而抑制肿瘤细胞的增殖或诱导凋亡。Vidic 等［21］通过体外实验，电转染特异的miRNA，靶向作用于K -ras 突变体，可以降低肿瘤细胞的存活率，未见不良反应。Liu等［22］对81 个大肠癌组织及配对正常组织中的miR-195 进行测定，显示其在癌组织中的水平显著下调，进一步将miR -195 体外转染大肠癌细胞系HT29 后，结果显示促进肿瘤细胞凋亡。Ruzzo 等［23］用定量RT - PCR 技术在结肠癌组织和细胞系DLD-1、SW480、COLO -201 中均检测到let -7 表达水平明显降低，将let -7a -1 前体转染入结肠癌细胞系DLD-1 和SW480，可观察到剂量依赖性生长抑制作用。

miRNA 也同样影响着化疗药物的抗肿瘤作用。体外和体内试验研究表明miR -129 可增加5 -Fu的细胞毒性效应，从而提高肿瘤对5 - Fu 的敏感性［24］。miR-143 在结肠癌中表达下调，有研究发现，通过在结肠癌细胞中上调miR -143 的表达，间接通过Bcl-2 等蛋白的下调而增加了5 -Fu 的细胞毒性，从而达到更好的化疗效果［25］。尽管有这些研究成果，还需要更多的研究去发现对大肠癌的治疗更有帮助的miRNAs。

5 miRNA 在大肠癌预后判断中的作用

越来越多的证据显示对某些特殊的肿瘤来说，miRNA 的表达方式是独一无二的，故被认为是一种潜在的癌症预后评估标志物。不同miRNA 的表达，有助于大肠癌的预后判断。一项对按国际抗癌联盟(UICC)标准治疗的大肠癌患者的研究发现，miR -152 和miR-148 的表达水平与大肠癌患者的预后相关，二者表达水平越低，肿瘤病灶越大且分化程度较低［26］。Schetter 等［27］的研究中比较了两组Ⅱ期结肠癌及毗邻正常组织的miRNA 表达谱，发现37个miRNA 存在表达差异，其中miR -20、miR -21、miR -106、miR -181 和miR -203 可能与预后相关，并随着其在肿瘤组织中的高表达，患者存活率降低。另有研究显示，miR -320 和miR -498 表达水平高的Ⅱ期结肠癌患者比那些低表达的患者无复发生存期要短［28］。

此外，还有许多研究显示miRNA 表达异常与淋巴结转移相关，如miR-129 和miR -137 在有淋巴结转移和无淋巴结转移的结肠癌患者中表达不同，有淋巴结转移者的表达量高于无淋巴结转移的患者［29］。Alina 等［30］对110 例有复发和无复发的I 期和Ⅱ期大肠癌患者研究发现，在大肠癌I 期，所检测的903 种miRNA 在大肠癌组织中的表达无论是在有复发组还是无复发组均没有差异;而在大肠癌Ⅱ期，miRNA-29a 在大肠癌组织中表达下调者预后更好，生存时间更长。上述研究表明，多种miRNA在大肠癌组织的表达与肿瘤的生长、淋巴结和器官的转移及病人的生存期有关，miRNA 有望成为大肠癌预后判断的标志物。

6 小 结

miRNA 在大肠癌的发生、发展、转移等过程中均起重要作用，进一步明确miRNA 的作用机制将有助于了解大肠癌发生的分子生物学过程，为大肠癌的诊断、治疗及预后提供新的思路。血清miRNA 作为分子标志物，与肿瘤的生物学机制密切相关，具有无创、简单、便捷、易于普查等特点，可能有助于改进疾病诊断，增加对预后估计的准确性，因而拥有广阔的发展前景。然而，miRNA 与其靶基因的相互作用是一个复杂的网络结构，既往研究结果亦显示，一个miRNA 可以调节多个靶基因，一个靶基因又可以受多个miRNA 调节，二者关系错综复杂，全面研究miRNA 的功能及构建miRNA 的调控网络十分困难，有待于进一步深入研究。

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