检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建

滑 翔，胡中凯，黄小波，文心田，曹三杰*，文翼平，伍 锐，邓 静，赵 松，尹人杰，常晓霞，欧阳达，张 仙

(1.四川农业大学动物医学院，猪病研究中心/动物传染病与基因芯片室，成都 611130；2.崇州市农村发展局，崇州 611200)

检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建

滑 翔1，胡中凯1，黄小波1，文心田1，曹三杰1*，文翼平1，伍 锐1，邓 静1，赵 松1，尹人杰2，常晓霞1，欧阳达1，张 仙1

(1.四川农业大学动物医学院，猪病研究中心/动物传染病与基因芯片室，成都 611130；2.崇州市农村发展局，崇州 611200)

猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是三种常见的仔猪病毒性腹泻病原，作者拟构建可同时检测三种病原的cDNA基因芯片。分别根据PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守区设计引物扩增靶基因，进行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA阵列设计，建立了扩增标记探针的多重PCR方法，并对所构建cDNA芯片的特异性、灵敏性、重复性进行了评价。确定了该cDNA芯片的阳性判断标准：SNR大于或等于2.0(或信号强度中位值大于等于1 500)。PEDV-TGEV-PoRV诊断cDNA芯片具有良好的特异性，该芯片不与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应；芯片的最低检测质量浓度为20 pg·μL-1；同一张芯片可重复使用至少7次。本研究为鉴别三种仔猪病毒性病的鉴别诊断提供了新的高通量检测技术。

猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪轮状病毒；cDNA芯片；构建

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis of swine，TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)是三种最常见的可引起仔猪腹泻的病毒，自2010年以来，以PEDV感染为主的仔猪病毒性腹泻已成为引起我国养猪业经济损失的最主要原因之一[1]，同时猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒也是经常检出的病原。这三种仔猪病毒性腹泻病经常存在混合感染，临床鉴别诊断较困难，因为其发病症状比较相似[2]，主要症状均表现为呕吐、水样喷射腹泻和脱水等，特别是哺乳仔猪发病严重且死亡率高[3-4]。因此，临床上对这三种仔猪腹泻病进行鉴别诊断非常重要。目前检测这三种仔猪病毒性腹泻的方法有病毒分离鉴定、环介导等温扩增技术(LAMP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(IFA)、病毒中和试验(VNT)、RT-PCR、实时荧光PCR等。然而，这些诊断方法都有一定的局限性，例如病毒分离不易成功且费时费力，血清学检测灵敏性低，检测过程中容易出现交叉反应。RT-PCR技术检测的样本数量有限，无法实现高通量样品的快速检测[5]。这些检测技术的共同缺陷是无法同时对大量临床样品进行快速鉴别诊断，因此急需一种高通量诊断技术来鉴别诊断三种仔猪病毒性腹泻病。

基因芯片技术是近年来迅速发展起来的一门新技术。在基片上点阵排列一系列靶基因，与荧光素等标记的探针分子在同一条件下进行核酸杂交，经过共聚焦激光扫描仪扫描、利用数据分析软件获得杂交结果。芯片技术具有自动化、平行性和高通量等潜在优势，能同时对多种疾病进行检测，因此它广泛应用于生命科学各领域[6-9]，在动物疫病研究方面(如病毒检测)也有大量报道[10-12]。针对当前我国仔猪病毒性腹泻发病严重的现状，作者选取PEDV、TGEV和PoRV的保守基因，设计了可同时检测三种病毒的cDNA芯片，拟建立联合检测这三种病毒的cDNA芯片技术，为仔猪病毒性腹泻的高通量快速检测提供了新的技术。

1 材料与方法

1.1 病毒株与重组质粒

TGEV、PEDV、PoRV均由四川农业大学猪病研究中心分离并保存。pMD-TS重组质粒、pMD-TN重组质粒、pMD-PS重组质粒、pMD-PM重组质粒、pMD-VP7重组质粒、pMD-NSP4重组质粒，均由四川农业大学猪病研究中心构建并保存。

1.2 主要试剂和仪器

反转录试剂盒、λDNA均购自宝生物(大连)生物科技有限公司；氯仿、无水乙醇等均为国产分析纯试剂；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均为OMEGA公司产品；总RNA提取试剂盒均购自天根科技(北京)有限公司；Baio® 氨基载玻片、Baio® 2×点样缓冲液、Baio®预杂交缓冲液、Baio®杂交缓冲液均购自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP，PA53 021，Lot300 989，Amersham Biosciences，UK；芯片点样系统：Capitalbio Corporation，芯片扫描仪：Capitalbio Corporation购自北京博奥生物公司。

1.3 引物设计

利用DNAMAN软件对GenBank上的TGEV、PEDV、PoRV毒株基因序列进行分析，分别针对TGEV的S、N基因，PEDV的S、M基因和PoRV的VP7、NSP4基因的保守序列，利用Primer5.0软件设计引物，扩增的探针大小在200～500 bp(引物序列参见表1)。定位基因则参照曹三杰的方法[12]，以PCR扩增，获得长度约为500 bp的λDNA目的片段。

1.4 重组探针质粒菌的复苏与鉴定

将含靶基因的重组质粒菌在LB液体培养基(含100 μg·mL-1的Amp)中复苏培养，提取质粒，质粒50倍稀释后取2 μL作为PCR模板，扩增体系：10×PCR Buffer(Mg2+free)5.0 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 4.0 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4.0 μL、特异性引物2.0 μL、质粒DNA 2.0 μL、TaqDNA酶0.5 μL、去离子水补足50.0 μL，反应程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共37个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 探针引物及扩增相关信息

Table 1 Information of primers for probe and length of fragment

基因名称Genename引物序列Sequencesofprimers扩增片段长度/bpThelengthoffragmentPEDV⁃M上游：5′⁃CTTATGGCTTGCATCACT⁃3′下游：5′⁃GCACTTTCTCGCTATCTG⁃3′421PEDV⁃S上游：5′⁃CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG⁃3′下游：5′⁃AATTGCTGGTTCCGCTGTAG⁃3′474TGEV⁃N上游：5′⁃TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA⁃3′下游：5′⁃TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT⁃3′362TGEV⁃S上游：5′⁃AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG⁃3′下游：5′⁃AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC⁃3′276PoRV⁃NSP4上游：5′⁃GAACAGGTTACTACTAAGGATG⁃3′下游：5′⁃TCACATAGACGCAGTTACTTCC⁃3′270PoRV⁃VP7上游：5′⁃TTGAATGAATGGCTATGTAATCC⁃3′下游：5′⁃ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT⁃3′381λDNA(AY319651)上游：5′⁃AAAGCGACGCAATGAGGCACT⁃3′下游：5′⁃GTTCCACGACCGCAACTGC⁃3′500

1.5 cDNA芯片的制备

利用接触式点样系统点制芯片，芯片的基片为氨基玻片。将制备的探针和定位基因稀释至200～300 μg·mL-1，加入等体积点样缓冲液。根据芯片设计的阵列，按顺序向96孔载样板孔内加入探针和定位基因，第一排及最后一排点为定位基因，其余各排点为相应的探针和空白对照，每排9个样点，各样点的中心距设置为500 μm，样点的直径设置为220 μm，点样环境的湿度设置在35%以上，温度为25～30 ℃。将点制好的芯片静置于点样仪上彻底干燥后，于60 ℃水合处理10 s，紫外交联30 min，预热0.2% SDS溶液洗涤5 min，蒸馏水快速洗涤后，1 500 r·min-1离心彻底干燥，真空密封后置4 ℃条件下保存备用。

1.6 cDNA芯片杂交

将制备好的cDNA芯片于100 ℃水浴变性5 min，立即置预冷的95%乙醇，上下抽提10次，1 500 r·min-1离心干燥。放入杂交盒中并盖上盖片，于盖片上点样孔向各个点样区缓慢加入50 μL的预杂交缓冲液，将杂交盒置于湿盒中，杂交仪中46 ℃下预杂交1.5 h。将制备好的靶基因95 ℃变性5 min，置于冰中冷却5 min，加入等倍体积预冷杂交缓冲液，混匀后，吸弃芯片上预杂交液，吸取60 μL混匀靶基因溶液，加于芯片点样区，盖片并避光，湿盒中48 ℃下杂交6 h。杂交结束后，在暗室分别用预热的洗涤液1、洗涤液2和洗涤液3中各浸泡4～5 min，装于塑料玻片盒，以1 000 r·min-1离心干燥。

1.7 cDNA芯片的扫描分析

利用扫描仪对杂交后的芯片进行结果扫描。扫描参数设置为PMT Gain 650，Laserpower 65%，分辨率为20 μm。扫描结束后，使用数据分析软件(LuxScan3.0)分析扫描结果。本研究选取每个基因的9个样点信号强度中位值的平均值和信噪比(杂交斑点信号中位值与斑点背景信号中位值之比)对杂交结果进行数据分析。

1.8 cDNA芯片的质量检测

随机挑选构建的cDNA芯片利用定位基因λDNA进行芯片质量检测。按程序依次进行预杂交、杂交、洗涤，结果扫描和数据分析。

1.9 探针的多重PCR标记方法的建立与优化

以病毒cDNA为模板，建立多重PCR方法，并对引物浓度及比例、Tm值、TaqE浓度、MgCl2浓度、dNTP Mixture与Cy3-dCTP的浓度以及循环数等条件进行优化。反应体系中依次加入10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，引物对混合物3.0 μL，cDNA模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，去离子水加至25 μL。反应条件：95 ℃4 min；93 ℃1 min；52 ℃1 min；72 ℃2 min；72 ℃延伸10 min，产物4 ℃保存备用。

1.10 cDNA芯片的特异性试验

用cDNA芯片探针引物扩增并标记PRRSV、CSFV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的模板来制备靶基因，分别利用制备好的芯片进行检测并进行数据的分析与处理。

1.11 cDNA芯片的灵敏性试验

选择PEDVM基因测定芯片的灵敏性：用杂交缓冲液将M靶基因稀释成3×100～3×104pg·μL-1，各取60 μL分别加于芯片的杂交区，在46 ℃下杂交6 h，扫描信号，进行数据分析。

1.12 同张检测cDNA芯片的重复使用试验

以PEDV-M作为靶基因与同一张芯片进行7次杂交，杂交后进行试验结果的扫描分析，变性除去杂交荧光，再以PEDV-M基因探针与其杂交，共杂交7次，观察该芯片的重复使用效果。

2 结 果

2.1 探针基因多重PCR标记条件优化结果

最终优化后的反应体系如下：Tm54 ℃，dNTP(10 μmol·μL-1)3.5 μL，MgCl2(25 μmol·μL-1)3.0 μL，TaqE(2.5 U·μL-1)0.55 μL，三对引物按2∶1∶1(NSP4∶TN∶PM)和1∶2∶1(PS∶TS∶VP7)的比例混匀后加入3.0 μL，加水补齐25 μL。反应程序94 ℃2 min；95 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。反应完毕后，取6.0 μL产物进行电泳分析，结果如图1。多重PCR标记条件优化后，杂交结果如图2。

2.2 cDNA芯片的特异性试验

分别用PRRSV、CSFV、JEV、PRV、PoRV、PEDV、TGEV等病毒检测PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片的杂交特异性。PRRSV、PRV、CSFV和JEV的杂交检测结果显示除定位基因(图3第一、九排)杂交斑点清晰可见外，无杂交荧光斑点，结果显示阴性。PEDV、TGEV、PoRV则在除定位基因(图3第一、九排)杂交斑点清晰可见外，在相应的诊断位置出现明显的杂交荧光斑点，结果显示阳性，结果如图3。

M.100 bp DNA相对分子质量标准；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.阴性对照M.100 bp marker；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.Negative control图1 多重PCR标记条件优化结果Fig.1 Multiple PCR marker conditions optimization results

图2 多重PCR标记条件优化杂交结果Fig.2 Multiple PCR conditions optimization hybridization results

2.3 cDNA芯片的灵敏性试验

用核酸蛋白仪测得靶基因的OD260 nm，换算成DNA浓度。按操作步骤进行梯度稀释，稀释后的质量浓度分别为3、10、20、50、100、200、500、1 000、10 000 pg·μL-1。探针DNA质量浓度在20 pg·μL-1时，基因杂交信号的中位值均大于1 500，且SNR大于1.5，可知cDNA芯片最低检测质量浓度为20 pg·μL-1，结果如图4。

2.4 cDNA芯片重复性试验结果

以PEDVM基因为例作为靶基因，进行单张芯片的重复使用试验。取一张芯片杂交后，扫描获取杂交结果，将该芯片变性消除杂交斑点，再将变性后的芯片用相同的探针进行第二次杂交，同样扫描获取杂交结果，如此重复七次。同一张芯片重复使用结果见图5。从图5可看出，该张芯片可重复使用至少七次，但是随着使用次数的不断增加，结果虽然仍呈阳性，但杂交信号值以及SNR值却不断减弱，背景值也随杂交次数的增加而不断增强。

a.PoRV检测结果；b.PEDV检测结果；c.TGEV检测结果；d.PRRSV检测结果；e.CSFV检测结果；f.JEV检测结果；g.PRV检测结果a.PoRV detection result；b.PEDV detection result；c.TGEV detection result；d.PRRSV detection result；e.CSFV detection result；f.JEV detection result；g.PRV detection result图3 特异性试验结果Fig.3 The specificity of the cDNA microarray assay

图4 灵敏性试验结果Fig.4 The sensitivity of the cDNA microarray assay

图5 单张芯片重复使用结果Fig.5 The repeated use of a single chip

2.5 样本检测结果

收集来自绵阳、阿坝茂县、彭州、资阳安岳、眉山、广安、攀枝花、巴中通江50份有腹泻症状且30 d以下的仔猪小肠。以及检测出有PEDV、TGEV、PoRV感染的41份相应仔猪小肠内容物作为芯片临床应用研究。RNA提取步骤按照总RNA提取试剂盒说明书完成，反转录后将得到的cDNA产物通过多重PCR标记进行靶基因扩增后，与芯片杂交，扫描分析数据。同时将cDNA产物按照常规PCR扩增，凝胶电泳分析结果。

表2 50份小肠样品的检测结果

Table 2 The detection rusult of 50 samples

感染类型Infectiontype常规RT⁃PCRRoutineRT⁃PCRcDNA芯片cDNAchip阳性数/样品数Positivenumber/samplenumber感染率/%Infectionrate阳性数/样品数Positivenumber/samplenumber感染率/%InfectionratePEDV36/507237/5074TGEV3/5063/506PEDV+PoRV2/5042/504PEDV、TGEV、PEDV+PoRV41/508242/5084

3 讨 论

基因芯片的载体主要包括玻璃片、硅片、尼龙膜片等多种材料[13]，其中玻璃基片价格便宜、制作简单、应用方便、荧光背景值较低、耐高温以及高离子强度的洗涤，而且玻片少孔，疏水性较强，大大减少了杂交液的使用量，同时又能够提高芯片的杂交效率[14]。本研究中制备得到的PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片是采用了氨基硅化处理过的氨基化玻片作为芯片的载体基片，制得了杂交信号稳定，能够长期保存使用的基因芯片。

核酸荧光标记分为间接标记和直接掺入法、Klenow聚合酶法及一些非荧光标记法[15-16]。其中间接标记法灵敏度高，但步骤较多，且标记后需要对标记产物进行纯化，增加了成本。Klenow聚合酶随机引物标记法中随机PCR存在非特异扩增，其灵敏度和特异性将会受到影响[17]。本研究中的标记物为荧光素是由本实验室采用的cDNA芯片扫描设备所决定的，探针是采用PCR扩增标记方法是因为在酶促反应中完成样品靶基因的特异性PCR扩增的同时，完成荧光标记，从而能够提高了芯片检测的特异性与灵敏度。文思远等[18]比较了三种基于PCR扩增的荧光标记方法：一种标记方法是采用了荧光分子标记引物进行标记，即荧光分子化学合成在引物的5′端；第二种则是在PCR反应体系中加入荧光分子修饰过的核苷酸，通过PCR反应将其掺入到DNA片段当中；而第三种方法则是利用非模板依赖性的酶促加尾反应，在DNA片段的3′末端随机加入经荧光素修饰过的核苷酸[18]。发现三种方法的标记效率基本一致，但是荧光标记引物的合成与保存则较为繁琐，而采用不对称PCR扩增方法进行标记的方法时，则需要不断摸索上下游引物的最佳比例，而酶促加尾反应则需要较为严格的反应条件[19]。本研究最终参照曹三杰等[11]在PCR反应过程中加入Cy3-dCTP取代dCTP，从而将荧光素Cy3掺入到PCR产物中。这主要是因为Cy3的分子量和空间位阻较大，所以只能使用Cy3-dCTP部分取代dCTP，才能够使PCR反应顺利完成。

靶基因的连接与探针的固定是构建基因芯片的首要条件。基于Northern印迹法中的探针和靶基因的特点，M.Schena等[20]在1995年用cDNA芯片检测基因表达一文中将连接在固体介质上的DNA称为靶标(靶基因)，用荧光素标记的样品称为探针。本研究采用PCR扩增的探针基因双链DNA片段，大小在200～500 bp。本研究采用的晶芯® LuxScanTM10K扫面仪结果分析软件具有多种数据输出方式，较常用的信号强度平均值、信号强度中位值、背景噪音中位值和背景噪音平均值等[21]。以信噪比(SNR)作为杂交阳性判断的标准相对较多，SNR是指杂交结果中的信号强度中位值与背景噪音中位值之间的比值，多以SNR≥1.5或者2.0为阳性标准，同时结合芯片杂交信号清晰程度，如杂交信号的中位值大于1 000或者1 500来作为阳性判断的标准。本研究中SNR是9个样点的信号中位值与背景信号中位值之间的比值，即以SNR≥2.0和杂交样点清晰，或者信号强度中位值大于1 500来为阳性判定的标准。

特异性与敏感性是衡量检测方法的两个重要技术指标，cDNA基因芯片检测特异性的必要前提是探针的特异性[21]，本研究制备的探针基因之间的一致性均低于50%，从而保证了cDNA基因芯片杂交检测的特异性。利用不同的病原对cDNA基因芯片进行了杂交检测，TGEV、PEDV、PoRV三种病原之间没有非特异性杂交，与PRRSV、PRV、JEV、CSFV之间杂交无非特异性杂交结果出现，证明本研究制备的PEDV-TGEV-PoRVcDNA基因芯片具有良好的特异性。灵敏性对检测方法同样重要，本研究构建的PEDV-TGEV-PoRVcDNA芯片的敏感性为20 pg·μL-1探针，与国内外有关报道稍有差异，这是由于所用芯片基片、所选探针基因以及制作的程序稍有差异而造成的。但是灵敏度仍明显高于某些报道中的多重PCR扩增检测三种病毒性腹泻疾病。cDNA基因芯片能否重复使用以及重复使用的结果关系到检测成本，本研究发现，若连续使用同一进行杂交检测同一探针，杂交信号的强度会随着杂交次数的增加呈减弱趋势，背景值则会不断增强。但是，连续使用7次，杂交信号的强度仍远远高于1 500，SNR也大于2.0，因而表明连续使用7次并不会影响到杂交检测的结果。本试验中背景效果并不是很好可能是由于在芯片的变性和洗涤的过程中，某些化学或者物理因素导致芯片上探针的脱落以及基片氧化，从而造成杂交信号的下降趋势以及背景值的增强。应用该基因芯片对四川地区的50份临床样品进行初步检测，结果与常规RT-PCR方法的吻合度高。试验结果说明建立的基因芯片方法可行且具有良好的特异性、灵敏性和重复性，具有良好的应用前景。

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(编辑 白永平)

Construction of cDNA Microarray for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Porcine Rotavirus

HUA Xiang1，HU Zhong-kai1，HUANG Xiao-bo1，WEN Xin-tian1，CAO San-jie1*，WEN Yi-ping1，WU Rui1，DENG Jing1，ZHAO Song1，YIN Ren-jie2，CHANG Xiao-xia1，OUYANG Da1，ZHANG Xian1

(1.ResearchCenterofSwineDisease/LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.InstitutionofRuralDevelopmentofChongzhou，Chongzhou611200，China)

Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)，Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV) and Porcine Rotavirus(PoRV) are three common pathogenies causing piglets diarrhea.A novel cDNA microarray was necessary to be developed to simultaneous detection of three diarrheal viruses successfully.To make this possible，primers and probes were designed to amplification of target genes according to the conserved sequences of PEDV-S，PEDV-M，TGEV-S，TGEV-N，PoRV-VP7 and PoRV-NSP4.Mutiplex PCR was established for labeling target genes after designing the microarray matrix and finally evaluated the specificity，sensitivity and repeatability of microarray.The positive judgement standard of microarray was determined：SNR(Signal to Noise Ratio) ≥2.0 or median signal ≥1 500.The result showed that PRRSV，CSFV，JEV and PRV could not be detected by six probes and as few as 20 pg·μL-1of target plasminds were detected successfully.One microarray could be tested at least 7 times.This assay provided a novel and high throughput detecting technology to identification and detection of three diarrheal viruses.

porcine epidemic diarrhea virus；transmissible gastroenteritis virus of swine；porcine rotavirus；cDNA chip；establish

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.015

2015-04-27

公益性行业(农业)科研专项项目(201203056)

滑 翔(1993-)，男，新疆哈密人，硕士生，主要从事动物疫病分子生物学研究，E-mail：huaxiang722@126.com。胡中凯，男，硕士生，从事动物传染病工作，在本研究设计和实施中做了重要贡献，为本文共同第一作者，E-mail：huzk1986@163.com

*通信作者：曹三杰(1971-)，男，山西乡宁人，教授，博士生导师，E-mail：csanjie@sicau.edu.cn

S858.285.3；S854.43

A

0366-6964(2015)12-2235-08