鸡KLF3基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响研究

王海霞，张志威,2，贺 綦，王 宁，王宇祥，曹志平，李 辉*

(1.东北农业大学动物科学技术学院，农业部鸡遗传育种重点实验室，黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030； 2.石河子大学医学院，石河子 832000)

鸡KLF3基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响研究

王海霞1，张志威1,2，贺 綦1，王 宁1，王宇祥1，曹志平1，李 辉1*

(1.东北农业大学动物科学技术学院，农业部鸡遗传育种重点实验室，黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030； 2.石河子大学医学院，石河子 832000)

为研究鸡KLF3(GallusgallusKrüppel-like factor 3，gKLF3)基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响，利用qRT-PCR检测了其在肉鸡脂肪组织和脂肪细胞中的表达特点，并利用基因过表达技术研究gKLF3基因对脂肪细胞分化的影响。结果显示，gKLF3在2～10周龄肉鸡腹部脂肪组织中持续表达，10周龄高脂肉鸡腹部脂肪组织gKLF3表达量显著高于低脂肉鸡(P<0.05)；gKLF3在鸡成熟脂肪细胞的表达量低于前脂肪细胞(P<0.01)；体外培养的鸡前脂肪细胞经油酸诱导分化后，gKLF3基因表达量均有低于对照组的趋势；过表达gKLF3基因有抑制脂肪细胞分化，以及抑制C/EBPα、FAS基因表达(P<0.01)的趋势。研究结果表明，gKLF3基因在鸡腹部脂肪组织生长发育过程中发挥重要作用，其可能是通过抑制C/EBPα、FAS基因表达进而抑制脂肪细胞分化实现的。

鸡；KLF3基因；脂肪细胞分化；基因表达

Krüppel-like factor 3(KLF3)具有3个典型的C2H2锌指结构，是Sp1/KLFs蛋白家族的一个成员，早在1996年，从小鼠红细胞(Murine erythroid cells)中克隆得到[1]。因为在其N端具有较多的碱性氨基酸，所以KLF3又被称为碱性KLF因子(Basic Krüppel like factor，bKLF)[1]。目前，KLF3已经被证实在哺乳动物的红细胞生成[2]、免疫反应[3]、自噬作用[4]、心肌细胞分化[5]和脂肪细胞分化[6]中发挥重要作用。

KLF3基因敲除小鼠(KLF3-/-)比正常小鼠拥有较少的白色脂肪组织，并且附睾脂垫中的脂肪细胞无论是数量，还是体积都小于正常小鼠[6-7]。细胞水平的研究证实KLF3在脂肪细胞分化中发挥作用。3T3-L1前脂肪细胞系的研究表明，KLF3基因的表达量随着脂肪细胞的分化而下降，强制表达KLF3基因抑制3T3-L1脂肪细胞的分化[6]，进一步的机制研究显示，KLF3通过抑制C/EBPα基因的表达抑制脂肪细胞分化。在秀丽隐杆线虫中的研究表明，KLF3通过调控脂肪酸去饱和途径基因的表达水平，参与调控维持正常脂肪酸复合物的形成[8]； 此外，KLF3是调控脂蛋白组装、分泌和脂肪酸β-氧化的重要基因[9]。

目前还没有关于KLF3基因在鸟类中的研究报道。本研究以东北农业大学肉鸡高、低脂系为试验材料，利用qRT-PCR的方法检测gKLF3基因在2～10周龄高低脂系肉鸡腹部脂肪组织、12日龄Arbour Acres(AA)仔鸡成熟脂肪细胞和前脂肪细胞，以及脂肪细胞分化过程中的表达特点；同时，通过基因过表达试验研究了gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化的影响，为进一步研究gKLF3基因调控脂肪分化的机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

东北农业大学肉鸡高低脂选择系第11世代2～10周龄公鸡[10]。每个时间点，高脂系、低脂系各取3只为试验材料，采集新鲜的腹脂样品于-80 ℃保存备用。12日龄的AA肉仔鸡由本课题组饲养。鸡KLF3基因过表达质粒(pCMV-myc-gKLF3)由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 鸡前脂肪细胞和成熟脂肪细胞分离 取12日龄AA肉仔鸡公鸡，超净台中取腹部脂肪组织(腹部及肌胃周围脂肪组织)放入装有磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿中；用PBS将脂肪组织洗2遍，尽量除去血管和筋膜，用眼科剪剪碎组织，大约剪到1 mm3体积大小；用0.1%Ⅰ型胶原酶的消化液消化组织，37 ℃消化65 min(每5 min摇匀1次)；消化完毕，加入全培养基终止消化，吸管吹打，静置分层，取上层油状物下的絮状物即为成熟脂肪细胞，其余部分分别经100和600目不锈钢筛网过滤，滤液分装入离心管中，2 000 r·min-1离心10 min；弃去上清，加入红细胞裂解液重悬细胞，室温静置10 min后，2 000 r·min-1离心10 min，弃上清，获得的沉淀即前脂肪细胞[11]。

1.2.2 鸡前脂肪细胞的培养和诱导分化 将分离的鸡前脂肪细胞沉淀加入适量的全培养基重悬、吹匀，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2 d换液1次，一般4～5 d长满，即可传代；当传代培养的鸡前脂肪细胞汇合至80%左右时，加入诱导培养基(含有160 μmol·L-1油酸浓度的培养基)进行诱导分化，每2 d换1次诱导培养基继续培养。

1.2.3 总RNA提取及反转录 按照TRIzol 试剂(Invitrogen)说明书提取鸡脂肪组织、成熟脂肪细胞和前脂肪细胞的总RNA。

1.2.4 油红O提取比色 在鸡前脂肪细胞诱导分化后的24、72、120 h，分别弃去培养基，用PBS洗3次，用10%甲醛固定30 min；然后用PBS洗3次，蒸馏水洗3次，再用0.5%的油红O染色液染色40 min；弃去多余的染色液，用PBS冲洗3次，室温干燥；加入100%异丙醇溶解细胞中的油红O，15 min后用分光光度计(510 nm)记录光吸收值。

1.2.5半定量PCR 根据NCBI数据库gKLF3基因预测序列XM_427367，利用Primer premier 5.0结合UCSC鸡基因组数据库跨内含子设计gKLF3基因表达分析引物，以gGAPDH基因为内参，半定量PCR用到的引物详见表1。扩增片段大小gKLF3基因为276 bp，gGAPDH基因为185 bp。循环次数分别为28和25。以脂肪组织和脂肪细胞的cDNA为模板，扩增片段，琼脂糖凝胶电泳获得电泳图片，利用Quantity one Bio-rad软件检测基因电泳条带的积分光密度IOD(Integrated option density，IOD)值。基因的相对表达量：

表1 用于PCR的引物

Table1PrimersusedforPCR

基因Gene引物(5'-3')PrimergKLF3F:CCAGCCAGTTCCTTTCATR:ACTTCCTGCGGAGACAATC/EBPαF:AGCTCGACCCGCTGTACR:TGTCTTTTTGGATTTGCFASF:AAGGAGGAAGTCAACGGR:TTGATGGTGAGGAGTCGβ-actinF:TCTTGGGTATGGAGTCCTGR:TAGAAGCATTTGCGGTGGgGAPDHF:CTGTCAAGGCTGAGAACGR:GATAACACGCTTAGCACCA

1.2.7 Western blot 待细胞培养至预定时间，弃培养基，室温下用PBS清洗细胞。然后向6孔板中加入细胞裂解液(RIPA Buffer)(每孔0.15 mL)，放置于冰上，轻轻摇动，作用15 min。裂解完成后，将含有细胞的裂解液移至1.5 mL离心管中。10 000 r·min-14 ℃离心10 min后，将上清(细胞总裂解物)转至新的离心管，与等体积凝胶加样缓冲液(2×)混合，在100 ℃加热3～5 min使蛋白质变性。每个样品取10～20 μL，采用BIO-RAD 的Mini-PROTEAN3电泳系统进行常规SDS-PAGE电泳。电泳结束后，采用BIO-RAD的Mini Trans-Blot将样品转移至PVDF膜，将膜置于封闭液(5%脱脂乳的PBST)，室温反应1 h，或4 ℃过夜。洗去膜上的封闭液，将膜孵育在含一抗(Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody)的PBST溶液，置于摇床上，室温反应1 h；洗膜后将膜孵育在含二抗(Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated)的PBST溶液；再次洗膜后常规ECL显色。

1.2.8 细胞转染 细胞转染按照罗氏FuGENE HD转染试剂操作说明书进行。

1.2.9 数据分析 数据分析采用Student-t，数据表示为“平均数±标准差(Mean±SD)”，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1gKLF3基因在高低脂系11世代2～10周龄肉鸡脂肪组织的表达分析

利用半定量PCR分析了gKLF3基因在东北农业大学肉鸡高、低脂系11世代2～10周龄肉鸡脂肪组织中的表达。结果显示，gKLF3在2～10周龄肉鸡腹部脂肪组织的生长发育过程中持续表达，10周龄时，高脂肉鸡腹部脂肪组织gKLF3表达水平显著高于低脂肉鸡(P<0.05，图1)。

2.2 鸡脂肪细胞中gKLF3基因的表达规律分析

利用qRT-PCR方法分析AA肉鸡前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中gKLF3基因的表达水平，结果显示，gKLF3基因在鸡前脂肪细胞(Stromal-vascular cell，SV)中的表达量高于成熟脂肪细胞(Fat cell，FC)(P<0.01， 图 2A)。此外，本研究发现，体外培养的鸡前脂肪细胞经油酸诱导分化后，gKLF3基因的表达量在4个时间点(24、48、72和96 h)均有低于对照组(未经油酸诱导)的趋势，但没有达到显著水平(图 2B)。

2.3 过表达gKLF3对鸡前脂肪细胞分化的影响

为了进一步研究gKLF3基因在鸡前脂肪细胞分化过程中的作用，本研究利用过表达技术分析了gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化的影响。在鸡前脂肪细胞中转染质粒pCMV-myc-gKLF3和pCMV-myc(Empty Vector，EV)，48 h后回收细胞，用myc标签抗体进行Western blot，结果显示pCMV-myc-gKLF3质粒能在前脂肪细胞中成功表达蛋白(图3A)。将鸡KLF3基因过表达质粒(pCMV-myc-gKLF3)转染到原代培养的鸡前脂肪细胞中，培养24 h后，加入油酸诱导细胞分化，油红O提取比色结果显示，在诱导后的24、72和120 h，与转染空载体的对照组细胞相比，过表达gKLF3基因的鸡前脂肪细胞中脂滴沉积出现减少的趋势，但没有达到显著水平(图3B)。

柱状图表示gKLF3的相对表达量(平均数±标准差)，*表示差异显著(P<0.05)The diagrams show the relative expression of gKLF3 gene(Mean±SD).* means significant difference(P<0.05)图1 gKLF3基因在脂肪组织发育过程中的表达Fig.1 Tissue expression pattern of gKLF3 gene in abdominal fat tissue during development

A.KLF3基因在原代分离(未经培养)的鸡前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中的表达规律；B.KLF3基因在油酸诱导分化的前脂肪细胞和对照组(未经油酸诱导分化)中的表达规律。**.差异极显著(P<0.01)。下同A.KLF3 mRNA expression in chicken preadipocytes(SV) and mature adipocytes(FC) were detected；B.KLF3 mRNA expression in preadipocytes which induced into differentiation by oleate and control group(which not induced into differentiation) was detected .** indicates significant difference(P<0.01).The same as below图2 gKLF3基因在鸡前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中表达特性Fig.2 Expression characteristics of gKLF3 gene in chicken preadipocytes and adipocytes

2.4 过表达gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因的影响

为了分析gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化的影响，利用qRTPCR检测了脂肪细胞分化过程的标志基因(FAS、C/EBPα)的表达变化。结果发现，过表达gKLF3基因，在24 h显著抑制C/EBPα基因的表达(P<0.01)，在72 h显著抑制FAS、C/EBPα基因的表达(P<0.01，图4)。

3 讨 论

KLF家族的成员在哺乳动物脂肪发育中发挥着重要作用[12-14]。在3T3-L1细胞系中的研究显示，KLF3是脂肪细胞分化的负调控因子，但是KLF3基因敲除小鼠的脂肪组织减少[6]，表明了KLF3在脂肪组织生长发育过程中具有多个调控功能，目前还没有关于鸟类KLF3的研究报道，本研究结果显示，gKLF3基因在高低脂系2～10周龄肉鸡腹部脂肪组织中均有表达(图1)，暗示了与小鼠KLF3相似，gKLF3基因在鸡脂肪组织生长发育过程中具有调控作用；在10周龄时，高脂肉鸡gKLF3基因表达水平显著高于低脂肉鸡(P<0.05，图1)，暗示gKLF3的表达水平可能是影响肉鸡腹部脂肪组织沉积的一个因素。

A.Western blot检验pCMV-myc-gKLF3在前脂肪细胞中的过表达效果；B.油红O提取比色分析过表达gKLF3基因对脂肪细胞脂滴沉积的影响A.Western blot analysis of gKLF3 overexpression in chicken preadipocytes transfected with pCMV-myc-gKLF3 or EV；B.The lipid content of chicken preadipocytes which were transfected with pCMV-myc-gKLF3 and pCMV-myc，induced into differentiate by oleate，and absorbance was measured at 510 nm图3 过表达gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化的影响Fig.3 Effects of gKLF3 gene over-expression on chicken preadipocyte differentiation

图4 过表达gKLF3基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因的影响Fig.4 Expression analysis of differentiation marker genes in gKLF3-overexpressing chicken preadipocytes induced into differentiation by oleate

进一步分析gKLF3基因在前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中的表达发现，gKLF3基因在前脂肪细胞中的表达量高于成熟脂肪细胞(P<0.01，图2A)，并且在油酸诱导分化的鸡脂肪细胞中，gKLF3表达水平有普遍低于对照组的趋势，暗示与哺乳动物相似[6]，gKLF3基因在脂肪细胞分化中可能具有负调控作用。为了进一步研究gKLF3基因对鸡脂肪细胞分化的作用，笔者在鸡前脂肪细胞中过表达gKLF3基因，油红O提取比色显示，在油酸诱导后的24、72和120 h，过表达gKLF3基因的脂肪细胞呈现脂滴形成减少的趋势(图3B)，进一步暗示gKLF3基因与小鼠KLF3类似[6]，在体外具有抑制前脂肪细胞分化的作用。

C/EBPα是哺乳动物和鸟类脂肪形成的重要调控因子[12，14-16]。C/EBPα基因敲除小鼠的研究表明，C/EBPα表达是白色脂肪组织发育的必须条件[17]。此外，C/EBPα在脂肪细胞终末分化中发挥重要调控作用[18-20]。FAS基因在动物体脂沉积中发挥了重要的作用[21]，它可以将碳水化合物合成脂肪酸，并以甘油三酯的形式储存[22]。本研究发现，过表达gKLF3基因，在72 h会显著抑制FAS、C/EBPα基因的表达，在24 h显著抑制C/EBPα基因的表达(图4，P<0.01)。笔者推断，与哺乳动物相似[6]，gKLF3基因可能通过抑制C/EBPα基因的表达抑制脂肪细胞分化。而gKLF3对FAS具有转录抑制作用，则暗示了与线虫KLF3[8]相似，KLF3可能具有抑制脂肪酸从头合成和调控脂类沉积的功能。

综上所述，本研究结果显示gKLF3和已经报道的哺乳动物及线虫中KLF3相似，在肉鸡脂肪组织生长发育中至少具有2个功能，即抑制脂肪细胞分化和调控脂类合成代谢。此外，gKLF3是否直接调控C/EBPα、FAS基因的表达等具体作用机制，还有待荧光素酶活性检测、染色质免疫共沉淀等试验的进一步分析和验证。

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(编辑 郭云雁)

Expression Pattern of Chicken Krüppel-like Factor 3 Gene and Its Effect on Adipocyte Differentiation

WANG Hai-xia1，ZHANG Zhi-wei1，2，HE Qi1，WANG Ning1， WANG Yu-xiang1，CAO Zhi-ping1，LI Hui1*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreedingofMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionatEducationDepartmentofHeilongjiangProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China； 2.SchoolofMedicine，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

This experiment was conducted to study the expression pattern of Krüppel-like factor 3(GallusgallusKLF3，gKLF3) gene，and its effect on adipocyte differentiation.The expression pattern ofgKLF3 in the adipose tissue and adipocytes of broilers were analyzed by using qRT-PCR.The effect ofgKLF3 on adipocyte differentiation was analyzed by over-expression technology.The result showed thatgKLF3 was consecutively expressed during the chicken adipose tissue development from 2- to 10-week-old.At 10-week-old，thegKLF3 expression in the abdominal fat tissues was significantly higher in fat line chicken than that in lean line chicken(P<0.05).Additionally，the significantly highergKLF3 expression level was observed in preadipocytes in contrast to that in mature adipocytes(P<0.01).The expression levels ofgKLF3 in preadipocytes induced by oleate were lower than that in control.Moreover，over-expression ofgKLF3 inhibited adipocyte differentiation and down-regulated expression ofFASandC/EBPα(P<0.01).The result indicate thatgKLF3 play an important role in the growth and development of chicken abdominal adipose tissue，and might restrain adipocyte differentiation by inhibiting the expression ofC/EBPαandFAS.

chicken；KLF3 gene；adipocyte differentiation；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.004

2014-05-07

国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102501)；国家肉鸡产业技术体系建设项目(CARS-42)；黑龙江省高等学校科技创新团队建设项目(2010td02)

王海霞(1987-)，女，山东烟台人，硕士生，主要从事家禽遗传育种研究，E-mail：haixiawang1025@126.com

*通信作者：李 辉，教授，E-mail：lihui@neau.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0026-06