细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4增强传染性法氏囊病病毒VP2质粒DNA的免疫效应分析

王永娟，朱善元，李碧春，胡 成，左伟勇*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300)

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4增强传染性法氏囊病病毒VP2质粒DNA的免疫效应分析

王永娟1，2，朱善元2，李碧春1，胡 成2，左伟勇2*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300)

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用，试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4，家兔毒性试验确定其安全性，后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验，设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组，免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价；鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击，连续观察2周并计算保护率。结果显示，mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别，mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组，疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明，构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质，并能产生很好的免疫保护率，为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。

传染性法氏囊病；分子佐剂；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4；VP2；DNA疫苗

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以破坏鸡的中枢免疫器官法氏囊为主，能导致鸡不同程度的病理变化、死亡和免疫抑制的高度接触性传染病[1-2]。目前，免疫接种仍是预防IBD的主要措施，但普遍使用的中等毒力活疫苗存在诱发法氏囊细胞凋亡和免疫抑制等缺点，加之变异毒株的出现使其预防效果有逐渐下降的趋势，因此迫切需要开展IBD预防新策略的研究[3]。

当前对流感病毒等易变病原的“通用疫苗”研究所取得的进展为新型IBD疫苗研制提供了借鉴[4-5]。LT是产毒性大肠埃希菌产生的一种不耐热肠毒素，具有很强的黏膜免疫佐剂活性，经过基因定点突变后的LT不仅没有毒性而且仍然保持了良好的黏膜免疫佐剂活性[6-8]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)属于免疫球蛋白超家族成员，是活化T细胞表面的一种跨膜糖蛋白分子，而CTLA-4胞外区能与抗原递呈细胞上的B7配体结合[9]。因此，用CTLA-4胞外区融合抗原免疫动物，作为抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂，不仅能诱导体液免疫应答，还能诱导细胞免疫应答[10，11]。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，携带了病毒主要的中和性抗原表位[12]，能诱导宿主产生IBDV的中和性抗体，从而保护易感鸡免受IBDV的感染[13]。本研究将IBDV VP2蛋白、大肠杆菌LT去毒突变体(mLT)及鸡CTLA-4胞外区进行重组，制备IBDV分子佐剂DNA疫苗，为IBD的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

载体pET-mLTA-CTLA-4(BL21)、载体pET-mLTA-VP2-CTLA-4(BL21)、鸡抗LT血清、鸡抗VP2血清由本实验室保存；纯化的肠毒素LT蛋白由扬州大学孙怀昌教授惠赠；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素、卡那霉素、甘油购自美国Sigma公司；尿素购自上海生工生物工程有限公司；双甲酰丙烯酰胺购自美国Promega公司；过硫酸铵和溶菌酶为AMRESCO产品分装；抗鸡IgG和IgA酶标抗体为英国Abcam公司产品；其他试剂为国产分析纯级。

1日龄非免疫健康雏鸡(雌雄随机)购自江苏省家禽科学研究所；2月龄健康家兔购自扬州大学比较医学中心；IBDV中等毒力活疫苗(NF8 株)购自扬州威克生物工程有限公司；IBDV野生毒株(LYG)由本实验室分离保存。

1.2 重组蛋白质的表达、鉴定与纯化

将重组菌pET-mLTA-CTLA-4和pET-mLTA-VP2-CTLA-4按文献 [14]方法用1 mmol·L-1IPTG诱导培养并收获细菌，同时设pET-32a空载体为阴性对照。超声裂解收获的细菌，上清和沉淀分别于12% SDS-PAGE胶中分析鉴定。分别以鸡抗LT血清、鸡抗VP2血清为一抗，酶标兔抗鸡IgG为二抗，进行Western blotting分析，DAB显色分析结果。

1.3 重组蛋白质安全性评价

选取3月龄家兔，参考文献[15]方法进行，家兔禁食24 h后无菌选择回肠袢，沿回盲部向上4～6 cm处开始结扎，共结扎7段，每段5 cm，每两段之间间隔5 cm，每段肠管均注入0.5 mL样品，并标记顺序，样品注射量见表1。继续禁食24 h后处死，观察回肠袢外观，抽取每段肠管内的液体，做计量比较。

1.4 动物免疫试验

将400只1日龄非免疫健康雏鸡饲养于清洁环境中，饲养观察10 d，随机分成8组(50只·组-1)，IBD中等毒力活疫苗+ mLTA-CTLA-4免疫组(第1～3组)，mLTA-VP2-CTLA-4免疫组(第4～6组)，IBD中等毒力活疫苗+生理盐水免疫组(第7组)，生理盐水免疫组(第8组)。重组蛋白质的免疫剂量分别为10、50、100 μg·只-1，免疫途径为肌肉注射， IBD中等毒力活疫苗的免疫途径为口服。动物每2周免疫一次，共免疫3次，三免后按首免剂量加强免疫一次。

表1 注入样品种类及数量

Table 1 Different sample and content in each loop

编号No.样品种类Smple蛋白质含量/μgContent体积/mLVolume1生理盐水0.00.52LT0.10.53LT1.00.54LT5.00.55mLTA-CTLA-45.00.56mLTA-CTLA-410.00.57mLTA-CTLA-450.00.5

1.5 检测样品准备

在每次免疫后第3天，随机从各组选取10只，断食不断水，24 h后处死，分别采集血液、收集小肠样品。血液于37 ℃静置2 h后，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清制得血清，-20 ℃保存备检。刮取约15 cm长小肠的黏液，盛放于事先校零过的空指形管，称重后生理盐水稀释，小量分装，-20 ℃保存备检。同时设免疫前血清样及小肠黏膜样为阴性对照。

1.6 抗原及样品最佳浓度确定

以横排作抗原(含IBDV的尿囊液20 μL)倍比稀释，纵列作血清或小肠黏液样品倍比稀释(起始浓度为100倍稀释的检测样品)，分别选择HRP标记兔抗鸡IgG或IgA为二抗，按间接ELISA操作步骤进行方阵试验。结果以抗体稀释倍数为横坐标，A450 nm值为纵坐标作曲线，考察不同包被抗原浓度曲线的平滑度。以A450 nm值为1.0左右对应的抗原浓度作为最佳包被浓度，抗体稀释倍数为最佳稀释倍数。

1.7 抗体的ELISA效价测定及分析

以方阵试验确定的抗原浓度包被ELISA反应板，1∶10 000稀释的HRP标记的鸡IgG或IgA为二抗，按间接ELISA操作步骤，测定待检样品的A450 nm值。以免疫次数为横坐标、A450 nm值为纵坐标作折线图，比较不同免疫组的IgG和IgA变化规律。

1.8 动物保护性试验

鸡加强免疫后第3天，用100LD50的IBDV野生毒株分别感染第1、4、7、8组中剩余的10只鸡，单独饲养观察2周后全部扑杀。以观察到鸡精神抑郁、反应迟钝、羽毛杂乱、腹泻、颤抖、极度虚弱，剖解见法氏囊及肾病变、腿肌和胸肌出血、腺胃和肌胃交界处条状出血为标准判断发病情况。

2 结 果

2.1 重组蛋白质的表达及鉴定

重组菌pET-mLTA-CTLA-4和pET-mLTA-VP2-CTLA-4在不同温度、不同时间及不同诱导剂浓度培养后，确定以37 ℃、1 mmol·L-1IPTG、诱导4 h为最佳诱导条件。诱导产物SDS-PAGE分析显示，与空载体相比，在42.5、92 ku处出现了预期大小的融合蛋白质，并以包涵体形式存在(图1、2)。

Western blotting检测结果显示(图3)，在42.5、92 ku处有特异性杂交信号存在，证明表达的蛋白质确为mLTA-CTLA-4和mLTA-VP2-CTLA-4，且具有反应原性。

2.2 重组蛋白质安全性评价

家兔安全性评价试验显示，第1段肠腔外观无异常，肠腔内几乎无液体，第2、3、4段肠腔均充血水肿，肠腔内有8～9 mL积液；第5、6、7段肠腔外观无异常，肠腔内几乎无液体；对照组和试验组动物在试验期内，均未观察到精神、行为、采食和生产性能的变化，亦未发生传染性法氏囊病。表明表达的重组蛋白质安全无毒性。

2.3 抗原及样品的最佳浓度确定

通过观察以间接ELISA的A450 nm值为纵坐标、抗体稀释倍数为横坐标制作的曲线，考察不同包被抗原浓度曲线的平滑度，确定A450 nm值为1.0左右时对应的IBDV尿囊液进行1∶128倍稀释为最佳包被浓度，血清样品进行200倍稀释，小肠黏膜样品进行400倍稀释。

2.4 血清中IgG的检测及其变化规律

以免疫次数为横坐标、各免疫组IgG 的A450 nm值为纵坐标作折线图，试验数据如图4所示， mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫组、mLTA-VP2-CTLA-4免疫组，分别与单独使用IBD疫苗免疫组相比，产生的血清IgG水平相当；而mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫组与mLTA-VP2-CTLA-4免疫组相比，产生的特异性抗体IgG水平略占优势；不同剂量的重组蛋白质免疫时，以10 μg·只-1的效果为最佳，且免疫效果在短期内有逐渐增强的趋势。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.pET30a 30 ℃诱导裂解物；2.pET-mLTA-CTLA-4 30 ℃诱导裂解物；3.pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃诱导裂解物；4.pET30a 30 ℃诱导表达产物上清；5.pET-mLTA-CTLA-4 30 ℃诱导表达产物上清；6.pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃诱导表达产物上清M. Protein molecular weight marker (Broad); 1. Lysate of pET30a induced expression products at 30 ℃; 2. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 30 ℃; 3. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃; 4. Supernatant of IPTG-induced pET30a transformant at 30 ℃; 5. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 30 ℃;6. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 37 ℃图1 重组菌pET-mLTA-CTLA-4的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-mLTA-CTLA-4

M.蛋白质相对分子质量标准；1. pET-mLTA-VP2-CTLA-4 37 ℃诱导裂解物；2. pET-mLTA-VP2-CTLA-4诱导表达产物上清；3. pET30a 37 ℃诱导表达产物上清；4. pET30a 37 ℃诱导裂解物；5. pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃诱导表达产物上清； 6. pET-mLTA-CTLA-4诱导裂解物M.Protein molecular weight marker(Broad); 1. Lysate of pET-mLTA-VP2-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃; 2. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-VP2-CTLA-4 transformant at 37 ℃; 3. Supernatant of IPTG-induced pET30a transformant at 37 ℃; 4. Lysate of pET30a induced expression products at 37 ℃; 5: Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 37 ℃; 6. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃图2 重组菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-mLTA-VP2-CTLA-4

M.蛋白质相对分子质量标准; 1.纯化的mLTA-VP2-CTLA-4;2.纯化的mLTA-CTLA-4M.Protein molecular weight marker(Broad);1.Purified mLTA-VP2-CTLA-4;2.Purified mLTA-CTLA-4图3 融合蛋白质的Western blotting检测Fig.3 Western blotting of purified fusion proteins

图4 免疫对血清IgG的影响Fig.4 Immune effect on IgG levels

2.5 肠黏膜抗体IgA检测及其变化规律

以免疫次数为横坐标、各免疫组IgA 的A450 nm值为纵坐标作折线图，数据如图5所示， mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫组、mLTA-VP2-CTLA-4免疫组，分别与单独使用IBD疫苗免疫组相比，产生的特异性抗体IgA水平相当；而mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫组与mLTA-VP2-CTLA-4免疫组相比，产生的特异性抗体IgA水平略占优势；同时发现，不同剂量的重组蛋白质免疫时，以10 μg·只-1的效果为最佳，且免疫效果在短期内有逐渐增强的趋势。

2.6 动物攻毒保护效果

动物攻毒保护试验结果如表2，mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫组、疫苗单独免疫组、mLTA-VP2-CTLA-4免疫组均未见发病及死亡情况，空白对照组发病10例、死亡1例。

表2 攻毒后试验鸡发病及死亡情况

Table 2 Incidence and mortality of chickens challenge with IBDV

免疫组Immunegroup发病数/总数No.ofonset/Total死亡数/总数No.ofdeaths/Total保护率/%Protectionrate10/100/1010040/100/1010070/100/10100810/101/100

图5 免疫对小肠黏膜IgA的影响Fig.5 Immune effect on intestinal mucosal IgA levels

3 讨 论

CTLA-4作为抗原递呈细胞上B7配体的结合位点，能够特异性地提呈免疫原，发挥抗原浓缩和靶向导入的作用。因此，以CTLA-4作为免疫佐剂时，B细胞仅需很小剂量的抗原刺激就能完成识别、活化、增殖、分化的过程，最后产生并分泌特异性抗体IgG，IgG可以有效中和体液中游离的病毒，从而减少对细胞的损伤，发挥抗病毒的作用[16]。从动物试验结果看，以低剂量10 μg·只-1免疫组的免疫效果为最佳，表明了CTLA-4抗原提呈的有效性与高效性。

肠道黏膜表面是机体与外界接触最多的部位，亦是大量病原微生物入侵机体的重要门户。LT是产毒性大肠埃希菌产生的一种不耐热肠毒素，具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性。经过基因定点突变后的LT失去了毒性作用，但仍然保持了良好的黏膜佐剂活性[17-18]。在进行安全性评价时，mLTA-CTLA-4的注射量换算成mLTA单体后亦远远大于LT的注射量，但仍未表现出毒性作用，这说明LT的无毒突变取得成功，且安全范围较广，即使mLTA-CTLA-4剂量增加数倍，也对机体没有损害。从动物试验结果看，mLTA-CTLA-4作为免疫佐剂对IBD活疫苗起到了免疫增强作用，表明载体pET-mLTA-CTLA-4可作为其他鸡相关病毒抗原表达的通用载体，与预期结果相吻合。

动物试验结果显示，重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4可诱导免疫鸡产生特异性IgG和IgA，但产生的IgA和IgG抗体水平低于mLTA-CTLA-4+IBD活疫苗免疫组，推测是由于活疫苗接种动物类似于机体产生一次轻型的自然发病过程，病毒在体内的作用时间长于DNA疫苗造成的。从保护力看，相同剂量mLTA-CTLA-4+IBD活疫苗免疫组与mLTA-VP2-CTLA-4免疫组对鸡的保护力均为100%，这将为用重组亚单位疫苗替代传统活疫苗，以“不变应万变”的免疫方案奠定基础。

4 结 论

构建了具有免疫佐剂作用的通用载体pET-mLTA-CTLA-4，制备了基于IBDV VP2蛋白的分子佐剂DNA疫苗载体，证实了CTLA-4对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用，为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。

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(编辑 白永平)

Analysis of Immune Enhancement of Molecular Adjuvant CTLA-4 on IBDV VP2 Plasmid DNA

WANG Yong-juan1，2，ZHU Shan-yuan2，LI Bi-chun1，HU Cheng2，ZUO Wei-yong2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.JiangsuProvincialKeyLaboratoryofVeterinaryBio-pharmaceuticalHigh-techResearch，JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege，Taizhou225300，China)

The study was conducted to evaluate the immune enhancement of molecular adjuvant CTLA-4 on IBDV VP2 plasmid DNA.Fusion protein mLTA-CTLA-4 and mLTA-VP2-CTLA-4 were expressed and purified based on vector pET-mLTA-CTLA-4 and pET-mLTA-VP2-CTLA-4.Protein toxicity tests were carried out on rabbits.10-day-old chickens were randomly divided into four groups，including different doses of mLTA-CTLA-4 plus IBD vaccine groups，different doses of mLTA-VP2-CTLA-4 groups，IBD live vaccine groups and control groups.Serum and mucosal samples were regularly collected for neutralization titer of IgG and IgA.After booster immunization，chickens were attacked by wild IBDV strain，and two weeks later protection rate were calculated.The results showed that levels of IgG and IgA in mLTA-VP2-CTLA-4 groups，mLTA-CTLA-4 with IBDV vaccine groups and conventional IBDV vaccine groups had no significant difference.IgG and IgA levels in mLTA-CTLA-4 with IBDV vaccine groups were slightly higher than that of mLTA-VP2-CTLA-4 groups.The protection rate was 100%.The results indicate that constructed IBDV molecular adjuvant DNA vaccine vector can express non-toxic recombinant protein，which can produce a good immune efficiency in chickens.It lays a foundation for further study on IBD subunit vaccine.

infectious bursal disease；molecular adjuvant；cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4；VP2；DNA vaccine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.019

2014-08-27

江苏省博士后科研资助计划(1401077B)；博士后日常资助项目；江苏农牧科技学院“凤凰人才工程”项目；江苏农牧科技职业学院重点支持项目(NSFZD1405；NSFZD1305)；扬州朝天歌农牧科技有限公司横向合作课题(00010114012)；江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室开放课题(JSKLKF1403)

王永娟(1980-)，女，江苏海门人，博士，副教授，主要从事生物工程技术研究，E-mail：43088591@qq.com

*通信作者：左伟勇(1978-)，男，山东泰安人，博士，教授，主要从事生物工程技术研究，E-mail:979490023@qq.com

S852.52

A

0366-6964(2015)05-0824-06