阿奇霉素对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症和气道黏液高分泌的影响*

任　薇，孙耕耘，王　胜，熊玲玲，朱春冬，李春颖，周　群(安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，安徽合肥3003;安徽中医药大学第一附属医院干部呼吸内科，安徽合肥300)

·短篇论著·

阿奇霉素对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症和气道黏液高分泌的影响*

任薇1，2，孙耕耘1△，王胜2，熊玲玲2，朱春冬2，李春颖2，周群2
(1安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，安徽合肥230031;2安徽中医药大学第一附属医院干部呼吸内科，安徽合肥230022)

目的:研究阿奇霉素对慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)模型大鼠的防治作用，从气道炎症及黏液高分泌角度探讨其作用机制。方法:将18只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、慢阻肺模型组、阿奇霉素治疗组，每组6只。通过烟熏及大鼠气管内注入脂多糖(LPS)的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。HE染色观察大鼠肺组织病理变化。肺功能仪检测大鼠肺通气功能。ELISA检测各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素(IL) -8、IL-17和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。Western blot及real-time PCR检测支气管肺组织中MUC5ac和Toll样受体4(TLR4)蛋白及mRNA的表达。结果:模型组大鼠支气管肺组织HE染色结果符合慢阻肺病理改变。与模型组比较，治疗组损伤程度显著减轻。模型组与对照组比较，肺功能明显下降，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明显增高(P＜0. 05)，肺组织中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表达水平显著增高(P＜0. 05)。与模型组比较，治疗组肺功能的下降减轻，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量的升高受到明显抑制(P＜0. 05)，肺组织中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表达水平的受到明显抑制(P＜0. 05)。结论:阿奇霉素可降低慢阻肺模型大鼠BALF中IL-8、IL-17和TNF-α水平，抑制肺组织内MUC5ac和TLR4蛋白表达，通过减轻气道炎症及黏液高分泌来达到防治慢阻肺的作用。

慢性阻塞性肺疾病;阿奇霉素;气道炎症;气道黏液高分泌

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of azithromycin on the rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD)，and to explore the underlying mechanism about the airway inflammation and mucus hypersecretion.METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal control group，COPD model group，azithromycin treatment group.The COPD model was established by the method of cigarette smoking combined with intratracheal injection of LPS.Pathological changes of the bronchi and lung tissues of the rats were observed with HE staining.Pulmonary ventilation function in the rats was detected with pulmonary function instrument.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA.The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in bronchi and lung tissues was determined by real-time PCR and Western blot.RESULTS: HE staining showed that the changes of bronchi and lung tissues in model group were consistent with typical pathological manifestations of COPD.Compared with model group，these changes were alleviated in treatment group.The pulmonary functions in model group were significantly decreased compared with control group.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF in model group were significantly increased compared with control group (P＜0. 05).The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels inmodel group was significantly higher than that in control group (P＜0. 05).Compared with model group，the degree of the descent in pulmonary function in treatment group was significantly lessened.Compared with model group，the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in treatment group were significantly inhibited (P＜0. 05).Furthermore，the expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in treatment group was significantly lower than that in model group (P＜0. 05).CONCLUSION: Azithromycin decreases the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of COPD model rats，inhibits the protein expression of MUC5ac and TLR4 in the lung tissues，thus playing a preventive and therapeutic role to reduce airway inflammation and airway mucus hypersecretion.

［KEY WORDS］Chronic obstructive pulmonary disease; Azithromycin; Airway inflammation; Airway mucus hypersecretion

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD;简称慢阻肺)是一种慢性呼吸系统疾病，主要以不完全可逆的气流受限为特征［1］。其气流受限进行性发展与气道慢性炎症反应增强相关。同时合并存在的黏液高分泌亦可导致气道狭窄，加快肺功能下降进程［2］。患者的不适多表现为慢性咳嗽、咳痰、胸闷气喘。阿奇霉素是大环内酯类抗生素，有临床研究发现长期小剂量阿奇霉素口服可预防慢阻肺急性发作，降低患者住院率及死亡率，但具体机制尚不清楚［3］。本研究拟从动物实验观察阿奇霉素对慢阻肺的防治作用，并探讨其是否可能通过改善气道炎症、改善气道黏液高分泌发挥作用。

材料和方法

1动物

18只雄性SD大鼠购于安徽医科大学实验动物管理中心(许可证号SCXK苏2009-0002)，清洁级，6～8周龄，体重(200±20) g。

2试剂与仪器

阿奇霉素(辉瑞公司) ; LPS(Sigma) ; RSE3020动物肺功能仪器(北京贝兰博科技有限公司) ; ELISA检测试剂盒(上海源叶生物技术有限公司) ; RIPA细胞裂解液(上海碧云天生物技术研究所) ; AF-10型自动制冰机(SCOTSMAN) ; JW-3021HR高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司) ; TRIzol Reagent(Invitrogen) ;逆转录试剂盒(Thermo) ; ABI2720型普通PCR仪(ABI) ; DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂) ;荧光定量PCR仪(Thermo)。

3主要方法

3.1大鼠COPD模型的建立SD大鼠标准饲料适应性喂养1周后随机分为3组:①正常对照(control)组，生理盐水10 mL·kg－1·d－1灌胃共8周;②慢阻肺模型(model)组:生理盐水10 mL·kg－1·d－1灌胃4周后，开始造模，造模第1天、第14天，腹腔注射6%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉大鼠，气管注入LPS 200 μL(1g/L)，第2～28天(第1天、14天除外)每日上午将大鼠置于密封的1 m3烟室中，持续吸入香烟烟雾(滁州烟卷厂生产的红三环香烟，焦油量19 mg，尼古丁1. 2 mg) 30 min，每天15支，每天熏1次，同时每天继续生理盐水灌胃;③阿奇霉素治疗(treatment)组，阿奇霉素(8. 3 g/L) 10 mL/kg灌胃4周后，造模方法同前，造模同时每天继续阿奇霉素灌胃治疗。造模4周后，处死大鼠。

3.2大鼠肺功能测定大鼠麻醉后分离暴露气管，进行气管插管并固定，用动物呼吸机测定用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、0. 1s用力呼气容积(forced expiratory volume in 0. 1 second，FEV0. 1)、呼气峰值流速(peak expiratory flow，PEF)。

3.3大鼠支气管肺泡灌洗麻醉状态下测定大鼠肺功能后，迅速打开胸腔，将灌胃针头从切口处插入气管，用4 mL生理盐水灌洗右肺，反复进行3次，共回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)约7 mL，1 500 r/min离心15 min，取上清－20℃保存。

3.4肺组织病理学检查取右肺组织，置于4%甲醛中固定24 h，常规梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色，光镜下观察肺组织病理改变。

当前HSE管理体系得到了企业和社会的共同认可，HSE管理体系建设、体系运行正在成为企业的重要任务。应从HSE管理体系运行的实际出发，以深入剖析、系统研究为基本路径，找到解决HSE管理体系运行问题和提升HSE管理体系运行效能的策略和方法，实现对HSE管理体系的系统改进和科学优化，在企业管理层面和功能体系上促进企业内在、全面、跨越式地发展。

3.5BALF中IL-8、IL-17和TNF-α含量的测定应用ELISA法进行检测，严格按照操作说明书进行。

3.6Western blot检测MUC5ac和TLR4的表达取新鲜肺组织，加蛋白裂解液冰上研磨裂解，加入EP管中反复冻融，离心后取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白进行SDS-PAGE，电转至PVDF膜上，分别加I 抗4℃过夜，PBS洗涤3次后，加入相应的II抗，室温孵育2 h，PBS洗涤3次，ECL试剂盒显色，X线胶片曝光。条带的灰度值用Bio-Rad图像分析系统测定。

3.7Real-time PCR检测MUC5ac mRNA和TLR4 mRNA的表达用TRIzol提取肺组织总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA模板，MUC5ac、TLR4、GAPDH引物序列见表1。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明设置PCR反应体系，具体如下: 2×SYBR Green Mixture 5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、双蒸水2 μL。以GAPDH为内参照，上机进行检测，扩增条件为: 95℃5 min; 95℃10s，60 ℃30 s，40个循环。目的基因的相对表达量采用2－ΔΔCt法计算。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4统计学处理

采用SPSS 17. 0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，继而采用SNK-q检验进行两两间比较。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠肺功能的检测结果比较

治疗组肺功能明显低于对照组，但显著优于模型组(P＜0. 05)，见表2。

表2　各组大鼠肺功能指标变化Table 2.Changes of lung function indexes (Mean±SD.n =6)

2各组大鼠肺组织病理学改变比较

对照组的支气管管壁未见增厚，支气管管壁及肺泡结构完整，纤毛未见脱落;模型组的气管壁增厚明显，管腔狭窄，肺泡结构破坏，融合成大疱，上皮细胞大量脱落，纤毛倒伏、脱落明显，支气管壁及血管周围有多种炎性细胞浸润;治疗组的支气管管壁轻度增厚，管腔可见局部轻度变形，部分肺泡融合，上皮细胞少量脱落，部分纤毛倒伏，支气管壁及血管周围可见少量炎性细胞浸润。模型组的支气管、肺组织改变符合慢阻肺的病理表现，治疗组支气管肺组织损伤程度轻于模型组，见图1。

Figure 1.The pathological changes of the rat lung tissues (HE staining，×100).图1　各组大鼠肺组织病理形态学变化

3大鼠支气管肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α含量的测定结果

模型组支气管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0. 05)，而治疗组均显著低于模型组(P＜0. 05)，见表3。

表3　各组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α的含量Table 3.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of the rats (ng/L.Mean±SD.n =6)

4大鼠支气管肺组织MUC5ac和TLR4蛋白相对表达水平

模型组支气管肺组织MUC5ac和TLR4蛋白表达水平均显著高于对照组(P＜0. 05)，而治疗组均显著低于模型组(P＜0. 05)，见图2。

5大鼠支气管肺组织MUC5ac和TLR4 mRNA相对表达水平

模型组支气管肺组织MUC5ac和TLR4的mRNA表达水平均显著高于对照组(P＜0. 05)，而治疗组均显著低于模型组(P＜0. 05)，见表4。

讨论

有研究显示熏香烟加气管注入内毒素所致大鼠呼吸系形态和功能的改变，与人类慢阻肺病理改变相符［4］。本实验通过烟熏和气管内注入LPS的方法复制慢阻肺大鼠模型。HE染色观察到慢阻肺组大鼠支气管壁及血管周围以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润明显，上皮细胞可见纤毛倒伏、脱落，杯状细胞增多，黏液腺体增生，气管壁胶原纤维显著增多，管壁增厚伴管腔狭窄，肺组织呈现肺泡结构破坏、肺泡腔扩大、融合成大疱等肺气肿改变。其肺功能指标下降明显，提示慢阻肺造模成功。慢阻肺表现气道慢性炎症病变，气道炎症可致杯状细胞增生，黏液分泌增加，而黏液分泌增加易继发感染加重气道炎症改变。气道炎症和气道高分泌二者互相影响。有报道显示大环内酯类抗生素具有一定的抗炎作用［5］，本实验观察阿奇霉素治疗组大鼠较模型组大鼠病理及肺功能均有明显改善，提示可能对于慢阻肺有一定的防治作用。

Figure 2.The protein expressions of MUC5ac and TLR4 in the bronchi and lung tissues.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05 vs control group;#P＜0. 05 vs model group.图2　支气管肺组织MUC5ac和TLR4蛋白表达变化

表4　各组大鼠支气管肺组织MUC5ac和TLR4 mRNA的相对表达水平Table 4.The mRNA levels of MUC5ac and TLR4 in bronchi andlung tissues (Mean±SD.n =6)

多项研究表明IL-8和TNF-α在慢阻肺气道炎症过程中发挥肯定而重要的作用［6-7］。其作为炎性反应因子，在慢阻肺患者痰液、血液和支气管肺泡灌洗液中均有显著升高［8-9］。近年来IL-17在慢阻肺发病研究中受到重视。研究表明IL-17能通过促进IL-8、TNF-α的释放，使中性粒细胞气道内聚集增多，参与慢阻肺气道炎症［10］。本研究显示模型组肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α较对照组明显升高，阿奇霉素治疗后相关指标下降，提示阿奇霉素对慢阻肺气道炎症的防治效果可能与此作用有关。

吸烟是COPD的主要病因之一，体内外实验均证实吸烟可促进MUC5ac的合成和分泌［11］。黏蛋白MUC5ac是气道黏液的主要成分，由杯状上皮细胞分泌，一些促炎因子如IL-1β、TNF-α，以及细菌毒性产物均可促进其合成［12］。有报道提出慢阻肺患者的气道中TLR4表达上调，诱导杯状细胞过度分泌MUC5ac黏蛋白，高黏液分泌状态导致气道炎症反应放大，是慢阻肺进行性发展的重要因素［13］。并且随着气道慢性炎症的长期存在，可诱导小气道中无黏液分泌功能细胞向黏液上皮细胞转化，过多黏液分泌加重气道的狭窄阻塞，加剧肺功能的下降［14-15］。本研究对于TLR4及MUC5ac黏蛋白通过Western blot和real-time PCR方法进行了定性定量分析，结果显示模型组较对照组大鼠支气管肺组织蛋白表达水平明显升高，阿奇霉素治疗组各指标较模型组明显下降。提示阿奇霉素可能通过改善控制气道黏液高分泌状态，以达到防治慢阻肺的目的。

慢阻肺发生发展与气道炎症、气道黏液高分泌密切相关。研究指出［16］阿奇霉素可抑制NF-κB表达。NF-κB具备多向调节功能，其作为上游启动因子涉及到慢阻肺气道炎症多个环节。炎症反应产生、炎症介质释放可激活NF-κB，NF-κB激活后进一步促进炎症介质释放，如TNF-α、IL-8等。其通过基因转录水平上的调控，可产生级联效应［17］。同时Fujisawa等［18］观察发现促炎因子IL-1β和IL-17A通过NF-κB通路转录机制，调控诱导气道上皮细胞分泌MUC5ac，提示NF-κB与细胞因子特异性结合，影响气道MUC5ac表达。TLR-4是病原分子识别受体，激活后可导致IκB磷酸化降解，参与NF-κB的激活［19］，引起核因子κB信号通路开放，诱导气道MUC5ac表达。阿奇霉素有可能通过NF-κB通路，达到改善气道炎症、控制气道黏液高分泌的作用。

总之，本研究显示，对于慢阻肺模型大鼠，阿奇霉素能够减轻慢阻肺相关病理损伤，减缓肺功能的下降，降低肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α炎症因子水平，降低大鼠支气管肺组织TLR4及MUC5ac黏蛋白表达，说明阿奇霉素有可能通过改善气道炎症和气道黏液高分泌，以达到防治慢阻肺的作用。

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(责任编辑:陈妙玲，余小慧)

Effect of azithromycin on airway inflammation and airway mucus hypersecretion in rats with chronic obstructive pulmonary disease

REN Wei1，2，SUN Geng-yun1，WANG Sheng2，XIONG Ling-ling2，ZHU Chun-dong2，LI Chun-ying2，ZHOU Qun2
(1Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230031，China;2Department of Geriatric Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230022，China.E-mail: sungengyun@tom.com)

R563. 3; R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.007

1000-4718(2015)10-1767-05

2015-04-28

2015-08-04

安徽高校省级自然科学研究项目(No.KJ2013Z182)

△Tel: 0551-62922904; E-mail: sungengyun@tom.com