载脂蛋白A-I模拟肽D4F通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡*

田　华，李严严，丁明德，杨娜娜，焦　鹏，桑　慧，，方永奇，姚树桐，△，秦树存△(泰山医学院动脉粥样硬化研究所，山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，附属医院，基础医学院，山东泰安7000)

载脂蛋白A-I模拟肽D4F通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡*

田华1▲，李严严1▲，丁明德2，杨娜娜1，焦鹏1，桑慧1，3，方永奇3，姚树桐1，3△，秦树存1△
(泰山医学院1动脉粥样硬化研究所，山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，2附属医院，3基础医学院，山东泰安271000)

目的:探讨载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)模拟肽D4F对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响，并阐明其可能的分子机制。方法:体外培养RAW264. 7巨噬细胞，给予12. 5、25和50 mg/ L D4F、5 mmol/L ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)或5 μmol/L二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)预处理1 h后，再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin，TM)继续培养24 h。MTT法检测细胞活力; TUNEL法检测细胞凋亡情况;试剂盒测定细胞内丙二醛(malondialdehyde，MDA)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性; Western blot法检测caspase-12的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似，D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬细胞活力降低和凋亡，且呈浓度依赖性(P＜0. 05)。与氧化应激抑制剂DPI相似，D4F显著抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应，表现为ROS和MDA生成减少(P＜0. 01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P＜0. 05) ;与PBA和DPI相似，D4F可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞caspase-12活化，且呈浓度依赖性(P＜0. 05) ;另外，D4F还可抑制TM诱导的caspase-12活化(P＜0. 05)。结论: D4F能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡，其机制至少部分是通过减轻氧化应激继而抑制caspase-12活化实现的。

载脂蛋白A-I模拟肽D4F; Caspase-12;氧化低密度脂蛋白;巨噬细胞;细胞凋亡

▲并列第1作者

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of D4F，an apolipoprotein A-I mimetic peptide，on oxidized lowdensity lipoprotein (ox-LDL) -induced macrophage apoptosis and activation of caspase-12，a key molecule in endoplasmic reticulum stress (ERS ) -associated apoptotic pathway，and to elucidate the underlying molecular mechanisms.METHODS: RAW264. 7 macrophages were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，4-phenylbutyric acid (PBA，5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI，5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM，4 mg/L) for 24 h.The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and TUNEL detection，respectively.The levels of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) in the cells and the activities of superoxide dismutase (SOD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase were determined.The protein level of caspase-12 was examined by Western blot analysis.RESULTS: Similar to the ERS inhibitor PBA，D4F protectedRAW264. 7 macrophages from ox-LDL or TM (an ERS inducer) -induced decrease in the viability and increase in apoptotic rate in a dose-dependent manner.Like DPI (an oxidative stress inhibitor)，D4F significantly inhibited ox-LDL-induced oxidative stress，as expressed by the decreased generation of ROS and MDA (P＜0. 01)，the increased activity of SOD and the decreased activity of NADPH oxidase (P＜0. 05).Moreover，similar to PBA and DPI，D4F significantly suppressed ox-LDL-induced activation of caspase-12 in a concentration-dependent manner (P＜0. 05).Furthermore，D4F also inhibited the caspase-12 activation induced by TM (P＜0. 05).CONCLUSION: D4F inhibits macrophage apoptosis induced by ox-LDL，and the mechanism is at least partially by reducing oxidative stress and inhibiting the activation of caspase-12.

［KEY WORDS］Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophage; Apoptosis

巨噬细胞源性泡沫细胞形成是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块的重要病理学标志，且其大量凋亡是易损斑块形成、破裂的重要因素，进而导致AS晚期临床急性心血管事件的发生［1］，而由C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和caspase-12等信号分子介导的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途径是导致巨噬细胞凋亡的重要机制［2］。因此，干预巨噬细胞ERS凋亡途径对阻止AS进展、降低急性心血管事件发生率具有重要意义［3］。近年来研究表明高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)主要蛋白成分载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)的模拟肽D4F具有促进巨噬细胞中胆固醇流出、抗炎、抗氧化和抗AS功能［4-6］。本实验室既往研究证实，D4F可抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤，且促进小鼠骨髓源内皮祖细胞功能，减轻其损伤［7-8］。另外，我们新近研究表明D4F可通过抑制CD36的表达和ERS-CHOP途径减轻巨噬源性泡沫细胞凋亡［9］。然而D4F是否通过抑制介导ERS凋亡途径的另一关键分子——caspase-12的活化来减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡?其上游分子机制又如何?上述问题的解决将为进一步阐明D4F的抗AS机制提供新的实验依据。本工作分别在ox-LDL和ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin，TM)所诱导的RAW264. 7巨噬细胞泡沫模型和ERS模型上，研究D4F对caspase-12活化和氧化应激反应的影响，以进一步分析其对巨噬细胞的保护作用和机制。

材料和方法

1主要试剂

D4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)和紊乱模拟肽(scrambled D4F，sD4F; Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK-NH2)购自中科亚光多肽服务公司; DMEM高糖培养基和胎牛血清(Gibco) ; ox-LDL(北京协生生物科技有限公司) ; 2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHFDA)购自Molecular Probes; 4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)、衣霉素(tunicamycin，TM)、二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)和抗β-actinⅠ抗购自Sigma;四甲基偶氮唑蓝［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］购自Genview;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记［terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) -mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡检测试剂盒购自Roche;抗caspase-12Ⅰ抗(Abcam) ;辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗(北京中杉金桥公司) ;增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒(Pierce) ;二氟化树脂(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜(Millpore) ;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶测定试剂盒(上海杰美科技公司) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2方法

2.1细胞培养与实验分组鼠源RAW264. 7巨噬细胞由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基，于37℃、含5% CO2的培养箱内培养，待细胞长至瓶底80%左右用于实验，处理前用无血清培养基同步化12 h。随机分为(1)正常对照(control)组:培养液中常规培养; (2) ox-LDL组:培养液中加入100 mg/L ox-LDL; (3) D4F预处理组:培养液中预先加入D4F (12. 5、25和50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (4) sD4F预处理组:培养液中预先加入sD4F (50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (5) ERS抑制剂PBA预处理组:培养液中预先加入5 mmol/L PBA作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (6)氧化应激抑制剂DPI预处理组:培养液中预先加入5 μmol/L DPI作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培养RAW264. 7巨噬细胞，预先给予50 mg/L D4F 或sD4F作用1 h，然后与ERS诱导剂TM (4 mg/L)共孵育。培养24 h后收集细胞。

2.2MTT法检测细胞活力胰酶消化细胞后接种于96孔板中，经处理后每孔加入20 μL(0. 5 g/L)的MTT，对照组加入PBS，避光37℃培养4 h，然后吸去培养液，加入150 μL DMSO后室温振荡10 min; 490 nm波长下，应用多功能酶标仪(Tecan)测定各孔的吸光度(A)值。以正常对照组细胞活力为100%，其余各组细胞活力以其A值占正常对照组A值的百分比表示，对结果进行统计分析。

2.3TUNEL法检测细胞凋亡在室温下，用4%多聚甲醛固定细胞30 min后，用PBS冲洗，然后用0. 1%的Triton X-100透化，在冰上孵育2 min。TUNEL反应混合物加入到细胞中，并在37℃避光孵育1 h，然后PBS洗涤细胞2次，每次5 min，再用DAPI溶液染色。应用荧光显微镜(Olympus)检测，以TUNEL阳性细胞与细胞总数之比来计算细胞凋亡比率。

2.4活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平测定

将细胞接种于96孔板，经处理后，装载DCHF-DA荧光探针，使其终浓度为10 μmol/L。在无血清DMEM中37℃孵育30 min后，洗细胞3次。多功能酶标仪(Qiagen)检测，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。以对照组ROS水平为100%，其它各组ROS水平以其荧光强度占对照组荧光强度的百分比表示。

2.5SOD活性和MDA含量测定细胞经处理后，收集并重悬于0. 5 mL裂解缓冲液中充分裂解，1 500 r/min离心10 min，应用试剂盒根据说明书检测上清液中SOD活性和MDA含量，分别用×103U/g蛋白和μmol/g蛋白表示。

2.6NADPH氧化酶活性测定应用光泽精增强化学发光法测定细胞内NADPH氧化酶活性，具体方法依据试剂盒说明书操作。

2.7Western blot实验按本室以往报道的方法［10］提取细胞总蛋白，等量的各组总蛋白于SDS-PAGE分离，待目的蛋白接近凝胶底部时停止电泳，4℃、100 V恒压电转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭、洗脱后与caspase-12多克隆Ⅰ抗(1∶1 000)和βactin (1∶6 000)单克隆Ⅰ抗室温孵育4 h，洗膜后与相应Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色抗原-抗体复合物，应用化学发光成像仪(上海欧翔科学仪器有限公司)进行图像采集。蛋白条带积分光密度(IA)值采用Image-Pro Plus 6. 0图像分析软件(Media Cybernetics)分析，以靶蛋白IA值/β-actin IA值的比值表示靶蛋白相对水平。

3统计学处理

数据用平均值±标准差(mean±SD)来表示。应用SPSS 13. 0统计软件进行单因素方差分析(oneway ANOVA)，以SNK法进行组间两两比较。以P＜ 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1D4F抑制ox-LDL和TM诱导的RAW264. 7细胞活力降低

RAW264. 7细胞经ox-LDL(100 mg/L)处理24 h，MTT检测细胞存活率降低47. 6%。然而，与ox-LDL处理组相比，用不同剂量的D4F(12. 5、25和50 mg/L)预处理细胞，细胞存活率剂量依赖性增加，分别升高27. 6%、53. 2%和60. 5% (P＜0. 05) ; ERS抑制剂PBA作为阳性对照预处理细胞后，也减轻了细胞活力的下降(P＜0. 05)，而紊乱模拟肽sD4F无此作用。此外，与ERS诱导剂TM处理组相比，用D4F (50 mg/L)预处理细胞1 h，细胞存活率升高了27. 7%(P＜0. 05)，见图1。

Figure 1.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced decrease in viability of RAW264. 7 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.图1　D4F抑制ox-LDL和TM所诱导的RAW264. 7巨噬细胞活力降低

2D4F抑制ox-LDL和TM诱导的RAW264. 7细胞凋亡

TUNEL染色证实D4F的抗凋亡作用。与ox-LDL处理组比较，用D4F(25和50 mg/L)预处理，细胞凋亡率分别降低了37. 7%和44. 3% (P＜0. 01)，结果与PBA预处理组相似，而sD4F预处理无此作用;同样，D4F也可以抑制TM诱导的细胞凋亡，凋亡率降低25. 9%(P＜0. 05)，提示D4F可能通过抑制ERS信号途径减轻巨噬细胞凋亡，见图2。

Figure 2.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced apoptosis of RAW264. 7 cells.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F，sD4F or PBA and then incubated with ox-LDL.The cell apoptosis was detected by TUNEL assay.The scale bar =20 μm.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.图2　D4F抑制ox-LDL和TM所诱导的RAW264. 7巨噬细胞凋亡

3D4F抑制ox-LDL和TM诱导的caspase-12活化

采用Western blot法检测caspase-12的剪切活化水平(cleaved caspase-12)，与ox-LDL处理组比较，D4F (25、50 mg/L)预处理组cleaved caspase-12水平减少了49. 8%和59. 0%(P＜0. 05)，其对caspase-12活化的抑制作用与PBA和NADPH氧化酶抑制剂DPI的作用相似，但是sD4F无此作用;同样，D4F也可抑制TM诱导的caspase-12活化(P＜0. 05)，见图3。

4D4F抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应

与ox-LDL组比较，D4F可以明显降低细胞内ROS水平和MDA含量(P＜0. 01)，并升高SOD活性(P＜0. 05)，其作用与DPI相似，见图4。

5D4F抑制ox-LDL所诱导的NADPH氧化酶活化

与DPI相似，D4F可以明显抑制ox-LDL所诱导的细胞内NADPH氧化酶活化，其活性较ox-LDL组降低28. 8%(P＜0. 05)，见图5。

讨论

在晚期AS病变中，富含脂质的巨噬细胞凋亡可促进病灶炎性反应、坏死和脂质核心扩大，这可导致斑块破裂和血栓形成，进而引起急性心梗、心源性猝死等急性心血管事件的发生［1］，因此，抑制巨噬细胞凋亡可能有效降低急性心血管事件的发生率。HDL是公认的具有胆固醇逆向转运、抗炎、抗氧化等抗AS作用的“好胆固醇”，ApoA-I是其主要蛋白成分和功能执行者。但是在AS患者体内HDL亚组分改变，如ApoA-I等蛋白成分因氧化或糖基化修饰而使其抗AS功能明显降低，且由于ApoA-I分子量大，制造起来非常困难并且昂贵，因此限制了其临床应用［11］。D4F是采用生物技术研制的18个氨基酸片段的Apo A-I模拟肽，具有Apo A-I类似的A型两亲性螺旋结构，能够促进泡沫细胞中胆固醇流出，抑制炎症和氧化应激反应，并可抑制AS小鼠粥样斑块进展［4-6，12］。我们既往研究证实，D4F可减轻ox-LDL所诱导的HUVECs损伤［7］，并可下调巨噬源性泡沫细胞清道夫受体A1表达［10］。本实验结果表明，D4F可抑制ox-LDL所诱导的RAW264. 7巨噬细胞损伤，表现为细胞活力增加、凋亡率降低。

内质网是真核细胞内进行蛋白质合成、加工、运输和钙储存的重要场所，也是损伤感知或凋亡信号整合的主要位点。氧化应激、钙稳态失衡、胆固醇超负荷等理化改变均可导致内质网功能紊乱，出现以未折叠/误折叠蛋白聚集和钙稳态失衡为主要特征的ERS反应。一定程度ERS通过暂时性减少蛋白质的合成、增强蛋白质的折叠及加快未折叠蛋白的转运等来减轻内质网的负荷，从而达到维持内质网功能和细胞生存的目的。但是过强或过久的ERS则可通过激活CHOP、caspase-12等信号途径触发细胞凋亡［2］。我们前期研究证实ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡是由ERS-CHOP信号途径介导的，而D4F可通过抑制该信号途径减轻ox-LDL对巨噬细胞凋亡的诱导作用［9，13］。Caspase-12是介导ERS凋亡机制的另一关键蛋白酶，定位于内质网膜，以酶原形式存在，在ERS时被特异性剪切激活，进而通过激活caspase-9和caspase-3，启动一系列caspase级联反应而诱导细胞凋亡［14］。文献报道，ox-LDL通过激活caspase-12诱导HUVECs凋亡［15］。本实验结果显示，以100 mg/L ox-LDL处理RAW264. 7巨噬细胞24 h，caspase-12剪切活化水平显著上调，而ERS抑制剂PBA不仅可明显抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤和凋亡，而且可减轻caspase-12活化，表明caspase-12是介导ox-LDL所致巨噬细胞凋亡的重要机制之一。与PBA相似，D4F不仅可减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞活力降低和凋亡，而且可抑制ERS诱导剂TM所诱导的细胞损伤和凋亡，另外对ox-LDL和TM所诱导的caspase-12活化均具有明显抑制作用，表明D4F可通过抑制caspase-12活化减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡。

Figure 3.D4F inhibited ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，sD4F (50 mg/L)，PBA (5 mmol/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.图3　D4F抑制ox-LDL和TM所诱导的caspase-12活化

Figure 4.Inhibitory effects of D4F on ox-LDL-induced oxidative stress in RAW264. 7 cells.The cells were pretreated with D4F (50 mg/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then stimulated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group.图4　D4F抑制ox-LDL所诱导的氧化应激反应

有研究证明ox-LDL的主要氧化脂质成分7-酮胆甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)经氧化应激反应引发人动脉平滑肌细胞［16］和兔动脉平滑肌细胞发生ERS［17］，表明氧化应激可触发ERS反应。本研究结果显示，氧化应激抑制剂DPI可抑制ox-LDL所致的caspase-12活化，表明ox-LDL通过氧化应激反应激活caspase-12介导的ERS凋亡信号途径。ox-LDL诱导的氧化应激主要来自NADPH氧化酶衍生的ROS生成过度和抗氧化酶活性的降低［18］。我们前期工作证实，D4F可通过抑制氧化应激增加色素上皮衍生因子的表达来减轻ox-LDL诱导的HUVECs损伤［7］。本研究结果显示，与DPI相似，D4F可抑制ox-LDL所诱导的NADPH氧化酶活化以及ROS和MDA生成，并上调SOD活性，提示D4F对caspase-12的抑制作用与其减轻氧化应激反应相关。

总之，本实验结果表明D4F可减轻ox-LDL所诱导的RAW264. 7巨噬细胞凋亡，其机制可能与减轻氧化应激继而抑制caspase-12活化有关。

Figure 5.D4F inhibited ox-LDL-induced NADPH oxidase activation in RAW264. 7 cells.The cells were treated as described and then the activity of NADPH oxidase was determined by lucigenin chemiluminescence.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ox-LDL group.图5　D4F抑制ox-LDL所诱导的NADPH氧化酶活化

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(责任编辑:林白霜，罗森)

Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12

TIAN Hua1，LI Yan-yan1，DING Ming-de2，YANG Na-na1，JIAO Peng1，SANG Hui1，3，FANG Yong-qi3，YAO Shu-tong1，3，QIN Shu-cun1
(1Institute of Atherosclerosis，Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities，2Affiliated Hospital，3College of Basic Medical Sciences，Taishan Medical University，Taian 271000，China.E-mail: yst228@126.com; shucunqin@hotmail.com)

R363. 2; R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.004

1000-4718(2015)10-1750-06

2015-04-23

2015-05-07

国家自然科学基金资助项目(No.81202949; No.81370381) ;山东省自然科学基金联合专项(No.ZR2014HL013) ;山东省医药卫生科技发展计划(No.2013WSB31009)

△姚树桐Tel: 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com;秦树存Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com