阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达的影响及其抑瘤作用

窦建卫 任翠翠 郝 云 严 然 杨亦奇

(1 西安交通大学医学部药学院,西安,710061; 2 甘肃中医学院基础医学院,兰州,730000; 3 成都中医药大学,成都,610065)

阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达的影响及其抑瘤作用

窦建卫1任翠翠1郝 云2严 然3杨亦奇3

(1 西安交通大学医学部药学院,西安,710061; 2 甘肃中医学院基础医学院,兰州,730000; 3 成都中医药大学,成都,610065)

目的：探讨阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达及其抑瘤作用。方法：将人乳腺癌细胞培养接种于裸鼠第四乳腺脂肪垫，建立裸鼠荷人乳腺癌模型，随机将荷瘤裸鼠分为5组：空白对照组、环磷酰胺组、阳和汤低浓度组、阳和汤中浓度组、阳和汤高浓度组，并于接种后14 d给药2周，给药结束后24 h麻醉,拉颈处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称取瘤质量并绘制瘤体生长曲线、计算抑瘤率及采用免疫组化法测定组织中CD90的表达。结果：1)环磷酰胺组及阳和汤组CD90表达均低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而环磷酰胺组与阳和汤组比较差异无统计学意义(P>0.05)，环磷酰胺组、阳和汤低浓度组、阳和汤中浓度组、阳和汤高浓度组的表达阳性率均数分别为0.34%、0.73%、0.52%及0.42%；2)环磷酰胺组及阳和汤组肿瘤体积及瘤质量均小于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而环磷酰胺组与阳和汤组比较差异无统计学意义(P>0.05)，环磷酰胺组、阳和汤低浓度组、阳和汤中浓度组、阳和汤高浓度组的抑瘤率分别为63.64%、37.45%、47.64%及63.27%。结论：1)阳和汤对人乳腺癌组织中CD90表达具有明显下调作用，可能是其抑制乳腺癌的作用机制之一；2)对人乳腺癌细胞的生长具有明显抑制作用。

乳腺癌；阳和汤；荷瘤裸鼠模型

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，在发达国家，乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤首位。据估计，2013年美国女性乳腺癌的新发病例234 580例，死亡病例40 030例[1]。我国虽属低发的国家，但其发病率也有明显上升趋势，中国肿瘤登记地区2009年恶性肿瘤相关数据显示，乳腺癌已位居女性恶性肿瘤的发病率首位[2]。据估计，全国每年乳腺癌的新发病例19万，严重威胁着广大女性的生命和健康。体外实验研究资料表明，阳和汤可运用于乳腺癌治疗，能影响细胞的周期分布，诱导肿瘤细胞的凋亡[3]。CD90已被证实对一些肿瘤有抑制作用[4]，其抑制肿瘤的作用很可能是通过上调血小板反应蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨粘连蛋白)及纤维连接蛋白实现[5]。本实验通过建立裸鼠荷人乳腺癌模型，探讨阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达的影响及其抑瘤作用，为进一步研究阳和汤治疗乳腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞及动物 人乳腺癌组织细胞系我院临床分离经传代培养后用于实验；SPF级nu/nu裸鼠30只，雌性，6～8周龄，体重(18±2)g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，饲养于西安交通大学实验动物中心SPF级动物实验室，保持恒定湿度和温度，饲养过程中所喂养的食物、水及饲养笼和垫料均经过高压灭菌消毒，垫料每天更换1次，裸鼠适应环境1周后开始进行成瘤实验。

1.1.2 药品及主要试剂 阳和汤浸膏由西安交通大学药学院提供；环磷酰胺购自山西普德药业股份有限公司；胎牛血清由我院自行制备；Leibovitz’s L-15培养基购自GIBCO公司；胰酶、青霉素-链霉素溶液购自碧云天生物技术有限公司。人抗人CD90单克隆抗体(美国Bioss公司产品)、二步法免疫组化试剂盒(SP-0023)(美国Zymed公司产品均购自北京博奥森生物技术有限公司。DAB显色试剂盒(AR-0612)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌组织细胞分离传代培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的Leibovitz’s L-15培养基中37 ℃培养，倒置显微镜下每天观察培养瓶中细胞生长情况，1～2 d换1次培养液，待细胞数达90%左右时进行传代培养。

1.2.2 人乳腺癌裸鼠模型的建立 收集对数生长期人乳腺癌细胞制成细胞悬液，用PBS缓冲液调整细胞浓度约2×107个/mL，于裸鼠第四乳腺脂肪垫接种，每只裸鼠接种0.2 mL，细胞数约为4×106个，建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，继续在SPF级环境下饲养，观察肿瘤生长。7 d左右即可见裸鼠皮下有肿瘤长出，用游标卡尺隔日1次测量肿瘤大小，14 d左右测量肿瘤体积约为100～200 mm3可用于实验(V=1/2ab2，a为最长径，b为最短径)。

1.2.3 实验分组与给药 接种后第14天随机将30只荷瘤裸鼠分成5组：空白对照组(0.9%氯化钠注射液)、环磷酰胺组(100 mg/kg)、阳和汤低浓度组(2.5 g生药/kg：相当于人用量5倍)、阳和汤中浓度组(5 g生药/kg：相当于人用量10倍)、阳和汤高浓度组(10 g生药/kg：相当于人用量20倍)，每组6只。次日开始给药，环磷酰胺组裸鼠腹腔注射给药1 mL/只，隔日1次，其他组裸鼠灌胃给药或生理盐水20 mL/kg，每日1次，连续2周。

1.2.4 观察指标

1.2.4.1 肿瘤生长情况 观察实验期间裸鼠精神状态、进食、排便及活动情况。于给药后第1天开始每3 d用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，取每组平均数，制作肿瘤生长曲线；计算抑瘤率：给药结束24 h后麻醉拉颈处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称取瘤质量，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。

1.2.4.2 组织中CD90表达影响 给药结束24 h后麻醉拉颈处死裸鼠，剥离肿瘤组织，采用免疫组化法检测不同组裸鼠乳腺组织标本中CD90的表达：肿瘤组织甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规脱蜡、水化，水浴法抗原修复，按试剂盒应用说明进行操作，树胶封片后进行显微镜下观察切片，采用二维细胞识别技术统计CD90的阳性率[6]。每张切片拍摄相同位置1×100的视野，取连续2个视野中均可见的细胞核做定位，记为有效细胞，确定每个切片1×100显微镜视野中有效细胞的个数并标记位置，计数单个及组合的阳性细胞数，统计阳性率(%)。

2 结果

2.1 成瘤情况 各组裸鼠接种人乳腺组织细胞7 d后均可见皮下肿瘤形成，且肿瘤生长迅速，成瘤率高达100%，各组裸鼠之间移植瘤体积无明显差异，裸鼠精神状态、饮食、排便及活动均无异常。

2.2 阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌瘤体生长影响 造模2周左右肿瘤可生长至实验所需大小，平均体积约为100～200 mm3，随机将动物分组进行干预，环磷酰胺组与阳和汤低、中、高浓度组裸鼠移植瘤生长缓慢，空白对照组裸鼠移植瘤生长仍然很旺盛。至实验结束，环磷酰胺组、阳和汤各组裸鼠移植瘤体积明显小于空白对照组，差异有统计学意义。肿瘤生长曲线见图1。

图1 不同实验组肿瘤生长曲线

2.3 阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌瘤质量和抑瘤率比较 环磷酰胺组、阳和汤组肿瘤质量均小于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而环磷酰胺组与阳和汤组比较差异无统计学意义(P>0.05)，环磷酰胺组、阳和汤低浓度组、阳和汤中浓度组、阳和汤高浓度组的抑瘤率分别为63.64%、37.45%、47.64%及63.27%，见表1。

表1 各组裸鼠荷瘤平均质量及抑瘤率的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与阳和汤低浓度组比较，△P<0.05。

2.4 阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达的影响 环磷酰胺组及阳和汤组CD90表达均低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而环磷酰胺组与阳和汤组比较差异无统计学意义(P>0.05)，环磷酰胺组、阳和汤低浓度组、阳和汤中浓度组、阳和汤高浓度组的表达阳性率均数分别为0.34%、0.73%、0.52%及0.42%，见表2。

表2 各组裸鼠荷瘤CD90表达阳性率的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

乳腺癌相当于中医学的乳岩。中医学认为其发生、发展是一个因虚致实、因实更虚、虚实夹杂的复杂过程，其实质仍为本虚标实证。古代医家对乳岩已有了较完整的认识，如《外证医案汇编》：“正气虚则为岩。”《诸病源候论》曾有“乳石痈”之说，《外科真诠》中有“石榴翻花发”之记载。《医宗金鉴》对其描述为“坚硬岩形引腋胸”，认识到乳癌晚期可转移至胸壁和腋窝。清·王维德在《外科证治全生集》中所创制之阳和汤具有温阳散寒通滞、化阴凝而布阳和之效，被广泛用于治疗“气血寒而毒凝”之阴疽等症，其后分析乳岩病因为哀哭忧愁、患难惊恐之情志所伤，病机为气血亏虚、阴损及阳、寒凝痰聚血瘀，病性属寒，其临床表现既虚且寒。故采用阳和通腠、温补气血之法，将阳和汤用于治疗乳岩[7]。

阳和汤由熟地黄，肉桂，麻黄，鹿角胶，白芥子，姜炭，生甘草等组成。方中重用熟地黄温补营血，且恐草木之品补力不足，依据“形不足者温之以气，精不足者补之以味”之说，选血肉有情之鹿角胶，补髓养血益精、壮筋健骨，二药配伍，阴中求阳，使阳得阴助，生化无穷，则温阳之功速达。肾藏精主骨，肝藏血主筋，精血充足则肝肾旺盛，肝肾旺盛则筋骨强，附着于筋骨之寒邪则可驱。寒邪附于肌肉、筋骨及血脉之中，炮姜炭、肉桂、麻黄、白芥子等温热之品，共奏驱散寒邪之功。其中麻黄、肉桂、炮姜配伍，王洪绪自解：“……治之之法，非麻黄不能开腠理，非肉桂、炮姜不能解其寒凝。此三味虽酷暑不可缺一也。腠理一开，寒凝一解，气血乃行，毒迹随之消矣。”而肉桂与炮姜炭均入血分，既可温经散寒、通阳散结解寒凝，又可引熟地黄、鹿角胶直达病所。麻黄辛温宣散开腠理，得熟地黄通络而不发表；大量熟地黄得小量麻黄，则补而不腻；白芥子通阳散滞而消痰结，可祛皮里膜外之痰。本方温阳散寒之法一者可以直化阴痰，二者使血得阳气而行，血瘀一解，则痰瘀肿块更易消散。甘草解毒且调和诸药。诸药共用，针对血虚阳伤之本，寒凝痰滞之标，是温阳药和补阴药合用，滋腻与辛散之品相配，温而不燥、补而不腻。配伍组方亦照顾全面，表里内外均有药物到达，使寒邪无稽留之所，则气滞、血瘀、痰凝、毒聚互结所生之乳岩自散。

阳和汤的现代研究文献甚多，高氏等采用荷瘤模型裸鼠进行在体抑瘤实验，对体外培养肿瘤细胞进行肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡实验，观察阳和汤对动物移植性肿瘤的抑制作用和可能的作用机理，结果发现阳和汤可明显抑制人小细胞肺癌在裸鼠体内的生长[8]。刘氏等将阳和汤用于乳腺癌晚期患者，配合党参、茯苓、半夏等可有效防治放、化疗消化道毒性反应，结果证实可增强免疫监视系统功能，提高机体细胞免疫和体液免疫，刺激骨髓造血功能，提高癌症患者体内cAMP水平；调整cAMP和GMP比值，有利于抑制癌细胞生长，增强化疗效果，并能促进核酸和蛋白质的生物合成，对化疗有一定的增敏增效作用，且能防治其毒性反应[9]。

本研究建立裸鼠荷人乳腺癌模型，通过体内抑制肿瘤生长实验，随着阳和汤浓度增加，瘤体组织中CD90表达明显下调，肿瘤体积与瘤质量逐渐减小，抑瘤率逐渐增加，与空白对照组比较差异有统计学意义，表明阳和汤在裸鼠体内可以抑制人乳腺癌细胞的增殖；实验研究还表明，阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达具有明显下调作用，此可能是其抑制乳腺癌的作用机制之一，阳和汤下调组织中CD90表达、作用于巨噬细胞通路，抑制肿瘤细胞增殖的机制有待进一步深入研究。

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(2015-01-08收稿 责任编辑：洪志强)

Yanghe Decoction's Impact on the expression of CD90 and its antitumor effect in nude mice bearing human breast cancer

Dou Jianwei1，Ren Cuicui1，Hao Yun2，Yan Ran3, Yang Yiqi3

(1SchoolofPharmacy,Xi’anJiaoTongUniversity,Xi’an710061,China; 2Basicmedicalcollege,GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China; 3ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610065,China)

Objective:To explore the effect of Yanghe Decoction on the expression of CD90 and its antitumor effect in nude mice bearing human breast cancer. Methods:The breast cancer cells were injected into the fourth mammary fat pads of nude mice， establishing the model of nude mice bearing human breast cancer. Then the mice were randomly divided into 5 groups: blank control group, cyclophosphamide group, Yanghe Decoction low dose group, middle dose group and high dose group. After 14 days inoculation, model mice were administered, tumors were collected after 2 weeks. Tumor weight and expression of CD90 were measured. Results: With regards to expression of CD90 and tumor volume and weight, cyclophosphamide group and Yanghe all dose groups were statistically lower than those of the blank control group (P<0.05), but there was no significant differences between the cyclophosphamide group and Yanghe dose groups (P>0.05). The positive expression rate of cyclophosphamide group, low, middle, high dose groups were 0.34%, 0.73%, 0.52% and 0.42%; the tumor inhibition rates were 63.64%, 37.45%, 47.64% and 63.27%. Conclusion: Yanghe Decoction can obviously inhibit the growth of human breast cancer cells and down-regulate CD90 in human breast cancer tissue, which may be one of the mechanisms of breast cancer inhibition.

Breast cancer; Yang He Decoction; Nude mice model

国家自然科学基金项目(编号：81473669)；四川省科技厅项目(编号：2014JY0243)

窦建卫(1968—)，男，陕西蒲城人，西安交通大学副教授，博士，研究方向：主要从事中药药效物质基础研究，E-mail:djw@mail.xjtu.edu.cn

杨亦奇(1990—)，女，山西潞城人，成都中医药大学硕士研究生，研究方向：主要从事肿瘤病证治法与方药研究，E-mail:1192457981@qq.com

R289.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.023