高良姜素对缺血性脑卒中大鼠脑线粒体代谢相关酶的影响

2015-03-21黄志英孙文利张晓旭吴传鸿段飞鹏田朋朋李韶菁颜天华

世界中医药 2015年3期

黄志英孙文利张晓旭陈畅吴传鸿高健段飞鹏田朋朋，3 李韶菁颜天华

(1 中国药科大学药学院,南京,211198; 2 中国中医科学院中药研究所,北京100700; 3 河北大学药学院,保定,071002;4 澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室,澳门,999078; 5 北京中医药大学中药学院,北京,100102)

黄志英1,2孙文利2,3张晓旭2,3陈畅2吴传鸿4高健2段飞鹏5田朋朋2，3李韶菁2颜天华1

目的:观察高良姜素对缺血性脑卒中大鼠脑线粒体能量代谢相关ATP酶的影响,探讨高良姜素通过干预线粒体能量代谢障碍发挥缺血性脑卒中保护作用的可能机制。方法:将120只雄性SD大鼠随机分成两大组,即术前给药组和术后给药组,每大组中又分为假手术组、模型组、阳性药银杏叶提取物EGb761组(mg·kg-1)及高良姜素高、中、低剂量组(100,50,25 mg·kg-1),每组10只。大鼠行中动脉栓塞手术前15 min或者术后6 h灌胃给药或给予等量生理盐水,于手术后24 h进行神经功能学评分,制备缺血侧脑组织线粒体悬液,并对其Na+-K+ATP酶,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶,Ca2+-Mg2+ATP酶活性进行检测。结果:高良姜素中剂量和高剂量组,Na+-K+ATP和Ca2+-Mg2+ATP酶活性均有明显提高(P<0.05),低剂量组酶活性无明显改变;相比较,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶活性各组之间没有明显的差别。结论:高良姜素能明显提高缺血性脑卒中大鼠脑线粒体Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性,缓解缺血脑细胞的能量代谢障碍,是其发挥脑缺血保护作用的可能机制之一。

高良姜素;缺血性脑卒中;线粒体;能量代谢;Na+-K+ATP酶;Ca2+-Mg2+ATP酶

脑卒中是一种发病机制复杂且具有严重危害性的脑血管疾病[1],其中以缺血性脑卒中为主,诸多实验表明,能量的耗竭是引起卒中脑组织损伤最初和最直接的因素。线粒体作为细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所,参与了缺血后脑细胞的能量耗竭,同时也是启动细胞凋亡的关键因素,在脑卒中的发生和发展过程中发挥着极其重要的作用。脑缺血可通过氧自由基等多种途径造成线粒体结构和功能异常,进而导致能量衰竭,最终诱发细胞凋亡或坏死,因此,线粒体是脑缺血的重要靶细胞器,其损伤的形成是脑缺血损伤的关键环节。

高良姜为姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根茎,性辛热,归脾胃经,具有温胃止呕、散寒止痛之功,常用于脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等证[2]。根据传统中医理论,瘀血阻滞、毒损脑络是缺血性脑卒中的关键病机,而高良姜辛热纯阳,芳香温中,血得温则行,得寒则凝,故高良姜可通过其温热走散的作用使气血得以通行[3],理论上对缺血性脑卒中可能有一定的治疗作用。

高良姜素是从高良姜干燥根茎中提取的天然黄酮类化合物,结构式见图1,是高良姜的主要成分之一,作为一种抗氧化物质被广泛使用,本实验室前期研究证实高良姜素对缺血性脑卒中大鼠具有明显的保护作用,且该保护作用与线粒体有关,但其具体作用机制尚未明确[4]。通过查阅相关文献,发现线粒体代谢相关ATP酶在线粒体内环境稳态的维持中起着重要作用[5],因此,本文以线粒体代谢相关ATP酶为主要研究对象,探索高良姜素对缺血后脑线粒体中Na+-K+ATP酶,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶,Ca2+-Mg2+ATP酶活性的影响,探讨高良姜素抗脑缺血的线粒体保护可能机制。

图1 高良姜素结构式(C15H10O5,MW:270.2369)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF/VAF级),体重250～270 g,雄性,120只,购自中国食品药品检定研究所。合格证号：SCXK(京)2009-0017。

1.1.2 药品及配制高良姜素(纯度98%)购自南京泽朗生物科技有限公司;阳性对照药银杏叶提取物EGb761购自德国威玛舒培博士药厂;蔗糖购自北京北化精细化学品有限责任公司;Na2EDTA,TrisBase购自美国Amresco公司;BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱生物技术有限公司;水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司;ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

高良姜素溶解于含5%吐温80的无菌生理盐水中;线粒体分离保存递质由蔗糖(250 mM)、Na2EDTA(0.5 mM)、Tris-HCl(10 mM)、BSA(0.1%)配制而成,pH=7.1,4 ℃储存。

1.1.3 仪器 pH计:上海精密仪器雷磁仪器厂;台式高速冷冻离心机:长沙湘仪仪器有限公司;迷你离心机:海门市其林贝尔仪器制造公司;M5多功能酶标仪(SpectraMax M5):美谷分子仪器公司;SE系列电子天平:上海奥豪斯仪器有限公司;普通称重天平:上海市奥豪斯仪器有限公司;组织匀浆器:涿州市琦瑞玻璃制品厂;磁力加热搅拌器:常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作参照Longa EZ等[6]建立的大鼠大脑中动脉内线栓法阻断方法,作适当的改进,大鼠大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血模型。于术后24 h进行神经症状学评分,并断头取脑,进行体外线粒体悬液的制备。10%的水合氯醛400 mg/kg,腹腔麻醉,将其仰卧固定,75%乙醇消毒颈部皮肤,于正中切口,分离并暴露右侧颈总动脉,并在近心端夹闭颈总动脉,继续分离出颈外和颈内动脉,结扎颈外动脉,在颈总动脉据分叉处1.5 cm处剪一个小口,用制备好的5 cm鱼线沿颈总动脉插入颈内动脉。当进入颈总动脉分叉处以上的鱼线长度为2 cm时,停止并结扎开口上下的颈总动脉。其中假手术组只进行术前麻醉以及血管分离,不进行线栓。整个手术过程室温保持在(22±2)℃。

1.2.2 分组与给药将120只雄性SD大鼠随机分成两大组,术前15 min给药组和术后6 h给药组,每大组中又分为假手术组、模型组及高良姜素高、中、低剂量组(100,50,25 mg·kg-1),每组10只。

1.2.3 神经功能学评分具体方法参照Bederson等[7]的五级评分法(0～4分),分数越高,说明大鼠神经功能损伤越严重。

1.2.4 样品制备造模后24 h取材,神经行为学评分后,取大鼠缺血侧脑组织制备脑线粒体悬液[8]。为了保持线粒体活性,整个操作应保持低温,精确切取大鼠脑缺血侧,左右脑均进行称重并记录,剥离缺血侧脑外膜和血管,按每500 mg脑组织10 mL预冷的分离递质的比例,分2次对脑组织进行洗涤。用弯头眼科剪将缺血侧脑组织剪碎,按5 mL/g组织的用量加入分离递质,转入预冷的匀浆器中,上下均匀匀浆30 s(尽量避免出现气泡),随即对匀浆液进行离心,按如下过程进行:1)600 r/min,离心半径8.2 cm,4 ℃,3 min;2)900 r/min，离心半径8.2 cm,4 ℃,5 min,取上清;3)10 000 r/min,离心半径6.3 cm,4 ℃,8 min;4)弃上清保留沉淀,加入新的分离液,至离心管三分之二处,调转离心管180度,使线粒体位置位于离心机内侧,4 ℃,10 000 r/min,离心半径6.3 cm,8 min。弃去上清,小心的获得沉淀,即为粗制的线粒体。取少量保存递质(1 mL/脑线粒体样品),将线粒体沉淀吹打均匀,操作过程中尽量避免气泡。制备线粒体后采用Bradford法进行蛋白含量检测,将蛋白统一定量为10 mg·mL-1。

1.2.5 四种线粒体代谢相关酶的测定按照试剂盒说明书,采用磷定量化方法,对缺血脑半球的脑线粒体Na+-K+ATP酶,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性进行检测。在含有140 mM NaCl,14mM KCl,5 mM MgCl2,0.5 mM EDTA，3 mM ATP,50 mM Tris buffer(pH 7.5)和0.01 mL组织匀浆液的孵育递质中对总ATP酶活性进行分析。37 ℃孵育1 h后,加入0.1 mL 5%十二烷基磺酸钠(SDS,sodium dodecyl sulfate)终止反应,检测分析递质中释放的无机磷酸盐含量。Na+-K+ATP酶活性的计算方法可认为是有无钠、钾离子时ATP酶活性的差别。Ca2+-Mg2+ATP酶活性的计算方法可认为是有无钙、镁离子时ATP酶活性的差别,酶的活性可表述为每毫克蛋白每小时释放的无机磷酸盐的微摩尔数(μmol Pi·h-1·mg-1)。

1.2.6 统计学处理统计分析采用SPSS 17.0软件进行,数据以平均值±标准差反映,采用单因素方差分析进行组间差异分析;P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能学评分如图2所示,术前15 min给药和术后6 h给药,MCAO术后24 h后的结果显示:与假手术组比较,模型组有统计学意义即表明造模成功(P<0.05)。与模型组比较,阳性对照药银杏叶提取物EGb761组和高良姜素(50 mg·kg-1、100 mg·kg-1)能降低动物局灶性脑缺血后的神经功能学评分,且有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。表明高良姜素高、中剂量可改善局灶性脑缺血引起的神经行为障碍。