疯牛病检测技术最新研究进展

2015-03-21郭家鹏朱利峰

河南畜牧兽医 2015年21期

关键词：朊病毒疯牛病抗体

郭家鹏，朱利峰

（1.河南省动物卫生监督所，河南　郑州　450008；2.河南省畜牧兽医服务中心）

疯牛病检测技术最新研究进展

郭家鹏1，朱利峰2

（1.河南省动物卫生监督所，河南郑州450008；2.河南省畜牧兽医服务中心）

疯牛病（BSE）的流行给许多国家的畜牧业带来了巨大的经济损失，并不断威胁人类健康。对于疯牛病的防制，有效的检测技术起十分重要的作用。对近年疯牛病检测技术的发展进行总结和展望。

疯牛病；朊病毒；畜牧业；检测技术

传染性海绵状脑病（TSE）是一类引起人和动物神经组织退化的疾病，包括人的库鲁病、克-雅氏病、吉-斯综合征、阿尔茨海默病以及动物的疯牛病、羊瘙痒病等。其中疯牛病发现的最早，动物采食含有朊病毒的肉骨粉可能引起该病的发生［1］。该病对养牛业发展和人类健康构成巨大威胁，并有“东扩”蔓延的趋势，已成为国际兽医学界和医学界共同关注的热点问题。

1　疯牛病流行状况及其检测技术研究的重要性

1.1疯牛病的病原

疯牛病的学名为牛海绵状脑病（BSE），病原为朊病毒，是一种无核酸的蛋白性侵染颗粒，属慢性进行性致死性神经系统疾病。目前认为BSE的病原为痒病相关纤维（SAF），这种纤维源自非常规变异蛋白（PrPsc），它的存在是BSE的一大特征。发生变异的蛋白引发人和动物的脑组织形成海绵状空洞，脑神经会渐渐变得像疏松的海绵体，脑功能出现退化，行动失去控制，四处盲目冲撞直至死亡。这就是疯牛病及其与人类相关的克-雅氏症等疾病的病因。科学家经过多年的研究还发现，老年痴呆症的病变蛋白与其有惊人的相似，它们在化学致病机制上有许多类似性。

1.2疯牛病的流行状况

1986年，英国首先发现并报道该病，1987年正式命名为牛的海绵状脑病，并且在世界上公开报道。1986年，英国首先发现并报道了14个病例，以后发病趋势加快，至1993年达到了高峰，病牛达到了3.7万多头。到1999年7月，英国确认的病例有17万多头。最新统计全球共有疯病牛20多万头，其中英国占180 376头，欧洲是重灾区［2］。除英国大规模的暴发外，美国、法国、德国、日本、荷兰、葡萄牙、西班牙、意大利、爱尔兰、瑞士、比利时、卢森堡、丹麦等20多个国家和地区发生了疯牛病［3］。但是这些国家基本上是散发性的，只有英国是大规模流行。疯牛病近年出现了东扩的趋势，日本已证实了疯牛病的发生，并且流行趋势相当严峻，不断有新病例发生的报道［4］。

1.3疯牛病检测研究的重要意义

疯牛病潜伏期比较长，一般为4至5年，而且机体不能对其产生免疫反应，对人类和动物都有极大的威胁性。强调疯牛病的严重性，不仅是因为疯牛病传染给人后会使人患上克-雅氏症，更因为人类目前对疯牛病还没有有效的防治和治疗措施，所以检测和诊断就显得尤为重要。

2　目前疯牛病检测技术的研究水平

目前，世界各国对疯牛病的检测尚无经济实用、简便高效的方法。对疯牛病的检测步骤一般为：先根据临床特征和流行病学资料做出初步诊断，再根据病理组织学变化、免疫学以及分子生物学检测等方法确诊。随着生物学及生物学相关边缘科学的发展，出现了许多新的检测方法。

2.1病理组织检测方法

可疑BSE病例被屠宰后，首要的诊断方法是病理组织学检查，当发现BSE特征性病变即海绵状空洞即可确诊。BSE病牛具体病理组织学变化是：脑两侧灰质神经丛对称性海绵样病变和脑干神经核神经元空泡化，以脑组织中淀粉样核心周围有由海绵样变性形成的“花瓣”组成的雏菊花样病理斑为特征。

2.2生物鉴定方法

通过被检标本匀浆（脑、脊髓、脾等）接种小鼠或仓鼠，接种动物3 d检查1次，濒死扑杀取脑组织做病理学检查。最后根据动物发病和死亡数计算终点滴度。仓鼠观察期为7～8个月，小鼠为12～36个月，而且代价高昂，临床不常采用［1，5］。

2.3免疫学检测方法

BSE诊断的实际应用需要更加快速并且可同时检测大量样本的方法，目前有多种免疫诊断技术可区分正常和异常的朊病毒蛋白，其中有些能精确确定朊病毒蛋白含量水平。

2.3.1免疫细胞化学法（ICC）

ICC试验利用抗原直接在组织切片上检查PrPsc。试验从每个脑组织上分别取延髓、脑桥、中脑、丘脑、大脑皮质、小脑组织做成切片，在切片上滴加第一抗体（如鼠抗PrP单克隆抗体FH11），第二抗体为标记有生物素的马血清。若病理组织切片中有PrPsc，就会与第一抗体结合，随后与第二抗体结合。再加入ABC（Avidin+ Biotin-peroxidase complex）试剂，后者可结合到第二抗体上。之后再加入底物（H2O2），即可出现反应。最后用苏木素复染，PrPsc呈红褐色。阳性对照切片是羊痒病脑组织切片，从而鉴定样品中有无疯牛病病原［6］。

2.3.2免疫组织化学法

免疫组化是利用标记的特异性抗体来显示组织切片上的PrPsc。其基本步骤是：将甲醛固定或石蜡包埋的组织标本经一系列预处理后，依次与特异性抗体和酶标记二抗反应，最后加底物显色，显微镜下观察。用该方法检测灵敏度、特异性都很高，且具有高度的解剖学分辨率，已成为传染性海绵状脑病的标准检测法［7-8］。有关专家利用该方法对英国和意大利的疯牛病的检测进行比较得到了相同的检测结果，进一步说明了该方法的可靠性。法国食品公共卫生部研究出的石蜡包埋斑点法（PET-blot）也可以用来检测受感染的脑组织。

2.3.3免疫印迹法

瑞士Prionics公司是疯牛病和羊痒病等朊病毒疾病早期诊断的全球领先企业。Pronics公司开发的免疫印迹法采用Westernblot法检测朊病毒蛋白，需要6 h就能出检测结果，这种方法现在被瑞士政府和英国授权用于牛的疯牛病管理，并可用于对潜伏期动物进行检测。目前，欧洲委员会建议，在欧盟监管项目的疯牛病检测中采用新型Prionics（R-Check LIA）法，LIA专门设计用来进行BSE检测，具有很高的精确性和可靠性。欧委会疯牛病专家的评估显示出百分之百的敏感性和特异性［9］。

2.3.4ELISA法

爱尔兰Enfer Scientific公司的ELISA法采用了新的抽取技术，利用化学荧光和多细胞抗-PrP抗体进行检测，约24 h出结果。这种检测方法已被爱尔兰政府应用于感染BSE的牛监测。法国和英国的Bio-Rad公司开发的Platelia试验和TeSeE试验采用夹心免疫法，约4 h出结果，该方法使用两个单克隆抗体，第一个抗体在固相中被免疫，而第二个抗体用共价酶做标记，PrP通过测量这种酶的活性来检测。该方法尤其适用于有大量样本的情况，与传统接种动物的方法平行对比，检测感染BSE牛脑组织稀释样本，准确性好，并有可能用于检测处于潜伏期的标本。日本东京Fujirebio公司研发的一步法ELISA试验将牛脑组织制备成匀浆悬液后，先用DNAse I和胶原酶（Collagense）处理，再用蛋白酶消化。之后，依次经过蛋白沉淀，耐受蛋白酶蛋白水解折叠，水浴超声悬浮，将悬浮物加到包被有特异单克隆抗体的微孔板，再加入HRP标记的检测抗体，TMB显色等试验步骤后，用酶标仪读取结果，显示出了很高的检测准确性。

2.3.5构象依赖性免疫测定法

美国加州大学旧金山分校（UCSF）的研究人员开发出的构象依赖性免疫测定方法（CDI），比现在应用的普通免疫测定方法能检测出更微量的prion蛋白，而且5 h即可出结果。该方法将可用于检测活动物而且准确性相当高，对西班牙、德国和英国的11 000头屠宰牛检测结果完全与现在应用的方法相符，而且在实验室和临床试验中，还没有发现假阴性或假阳性结果。另外，该方法的另一突出优点是自动化，因此可以用于大量动物的筛选［10］。

2.3.6免疫荧光法

EGG Wallac的基于免疫荧光方法的Delfia试剂，敏感性比较高，该方法检测是使用两个单克隆靶PrP的非竞争性检测方法，英国的农渔食品部（MAFF）已同意将其用于检测英国的牲畜。德国学者研制出利用荧光相关光谱检测疯牛病的方法，可以不用蛋白激酶K进行消化，这对于潜伏期动物的诊断有很大的优势。

2.3.7高效色谱免疫分析法

高效色谱免疫分析法于2004年被欧盟委员会接受用于疯牛病的检测，巴萨罗那大学研究的Prionics-Check PrioSTRIP是一种针对疯牛病开发的高效色谱免疫分析法，也有很高的可靠性。

2.3.8鸡卵黄抗体检测

日本广岛大学、国家动物健康研究所和广岛科技研究所的研究人员重组了一种可以检测疯牛病的鸡卵黄抗体（IgY），这种抗体的可变区包括Ab3-15和Ab4-19两个抗哺乳动物朊病毒蛋白的区域，从而能敏感的识别PrPsc蛋白准确检测疯牛病。

2.4分子生物学检测方法

2.4.1Westernblotting检测法

中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室的王辉暖、赵德明等于2007年以朊蛋白单抗AH6和碱性磷酸酶标记的马抗鼠酶标二抗建立了疯牛病和羊痒病的Western blotting检测方法。其敏感性为100%，特异性为99.4%，与进口试剂盒无显著差异，这为国产试剂盒研制提供了条件［11］。国家疯牛病参考实验室利用小鼠骨髓瘤细胞和经过重组鲁西黄牛PrP或重组小尾寒羊PrP免疫的脾细胞建立了5个杂交瘤细胞系。经过Western blot反应，其中有4组可以识别牛和羊的re-PrP、PrPc和PrPsc，两组只能识别羊的re-PrP和PrPsc，对牛和羊的PrPc都不能识别，利用此方法可以进行疯牛病的监测。荷兰动物疾病中心利用咽喉淋巴结进行Western blotting检测，不但能检测疯牛病而且可以区分疯牛病和羊痒病。

2.4.2疯牛病特殊风险物质荧光RT-PCR检测法

北京出入境检验检疫局的史喜菊等人建立了检测牛肉中疯牛病特殊风险物质（主要是中枢神经组织）标记物胶原纤维酸性蛋白（GFAP）mRNA的荧光RT-PCR检测技术。能从牛源和羊源的中枢神经组织中检测到GFAP［12］。

2.4.3利用红细胞分化相关因子（EDRF）检测法

英国的中洛锡安群罗斯林研究所的Gino Miele等人利用cDNA的差异显示分析，来鉴定在朊蛋白疾病中具有异常表达的EDRF转录物。朊病毒侵入大脑前首先在脾脏复制，由此他们推测朊病毒可能会影响基因表达，于是他们分析了来自正常小鼠脾脏和BSE感染小鼠脾脏的RNA转录物。结果发现，在感染小鼠的脾脏中，EDRF的转录水平下降，不仅如此，受感染小鼠的血液和骨髓也存在EDRF的减少，在羊痒病患羊和BSE患牛的骨髓中，EDRF的水平同样低于正常。由此判断不论EDRF是否参与致病，它可能会成为很好的诊断标记物。

2.4.4利用标记核糖核酸检测法

2004年德国吉森兽医与食品研究所米夏埃尔·比尔特教授等开发出利用核糖核酸（RNA）作为标记物的检测方法。动物中枢神经系统中含有胶质纤维酸性蛋白，而合成这种蛋白质的过程中会产生信使RNA，通过实时聚合酶链反应，就能找到信使RNA的痕迹，进而判断肉类食品中是否掺入了含有疯牛病病毒粒子的脑或脊髓组织［13］。

2.5其他检测方法

2001年，美国和英国合作研制出通过检测尿液诊断疯牛病的方法。可检测到病牛尿液中的疯牛病因子，而且特异性很好［14］。俄罗斯科学家用人工方法合成了疯牛病的普里昂蛋白质，并培育出有彩色标记、能攻击正常的普里昂蛋白质的抗体。检测前先向脑组织中注入一种酶，这种酶只能与正常的普里昂融合在一起。由于人工抗体带有彩色标记，故显微镜下所有普里昂蛋白质周围都会出现彩色亮点。通过观察这些蛋白质是否与特殊酶发生融合，便可以分辨出是否有变异普里昂蛋白质（未与特殊酶融合的）存在，从而可以断定被测的牛是否患上BSE［15］。

2003年，英国根据疯牛病感染牛出现异常的脑电图的现象，将其作为疯牛病的生前诊断，英国脑电图诊断法作为法定的诊断方法［16］。同年，英国四家机构的神经学家和辐射学家称，利用磁共振影像，以高功率将焦点集中于大脑的中央部位的尾丘脑。疯牛症典型特征的脑细胞丧失的形状，就会在影像的黑斑中显示出来，因此，也可利用此法进行疯牛病的诊断［17］。

2004年，美国北达科他州立大学（NDSU）科研人员研究出使用无线射频识别技术（RFID）来检测疯牛病的方法［18］。

2005年，日本九州大学研究出对异常普里昂蛋白质有特殊捕捉能力的有机分子和电化学显色剂相结合的电极装置检测法，该方法不但精确度高，节约检测时间，而且可以用于20个月以下小牛的检测［19］。

2007年，德国科学计算跨学科中心和Heidelberg大学研究利用红外光谱特征检测活牛血清来诊断牛是否染上疯牛病。同年，多位科学家研究发现构成朊蛋白基因（PRNP）的多态性和疯牛病的发生有很强的关联性，通过该项检测也可以间接确定疯牛病的发生。

3　疯牛病检测技术研究发展方向

疯牛病活体检测是当前和今后一段时间内疯牛病研究的难点和重点。目前已取得了一些进展：除了前面所提到的尿液诊断法、脑电图诊断法、磁共振影像法、无线射频识别法、红外光谱特征检测活牛血清法、血纤维蛋白溶酶原早期检测法。其他的方法还有：荷兰研究的活体动物采血检测法；英国曼彻斯特大学利用心电图来监测在感染BSE的早期阶段的心率变异信号，从而来检测疯牛病以及诊断人类变异克雅氏病；德国哥廷根大学开发出一种在活牛身上检测疯牛病的血液检测法［20］。

我国目前没有发现疯牛病，但从其发病机理和我们与国外在畜牧业方面的贸易往来史看，仍然不能放松警惕。在欧洲真正认识疯牛病之前，我们从英国等欧洲国家引进种羊和种牛的同时就有可能埋下了隐患。国内基层对疯牛病认识不足，缺乏有效、快速的检测手段，疯牛病可能随着经济交往和人员交流而形成全球化。所以目前当务之急就是找到一种特异性高、简便、非创伤性和有早期诊断意义的检测方法。鉴于目前对疯牛病检测试验需要的迫切性，相信这些问题很快会得到解决。

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