人参根组织形态及其生理生化活性成分相关性研究

王曼莹， 靳雯棋， 郭海洋， 王泓骁， 孙立伟

(北华大学 化学与生物学院， 吉林 吉林 132013)



王曼莹， 靳雯棋， 郭海洋， 王泓骁， 孙立伟*

(北华大学 化学与生物学院， 吉林 吉林 132013)

为了探讨人参根组织形态及其生理生化活性成分的相关性，利用番红-固绿双重染色观察人参组织形态，紫外分光光度法和ELISA等方法测定其代谢物含量和相关酶活力，并比较人参生物量的差异.结果表明园参比根重高于林下参，但其树脂道、周皮木栓层细胞和韧皮部裂隙却不如林下参发达，皂苷和丙酮酸含量及苹果酸脱氢酶(MDH)活力也低于林下参；林下参比根长与抗氧化相关代谢物含量及酶活力随年限增加而降低，但其树脂道、周皮木栓层细胞和韧皮部裂隙逐渐发达，皂苷、淀粉和丙酮酸含量及MDH活力均升高.而且随人参生长年限的增加，能量代谢逐渐增强，分泌组织(树脂道)和贮存组织(周皮木栓层细胞、韧皮部裂隙)趋于发达，使根逐年增粗增重；皂苷含量的变化与其周皮木栓层细胞和韧皮部裂隙的变化呈正相关性；抗氧化能力与周皮木栓层细胞的紧密性呈负相关.这均为利用人参形态来评价其质量提供了实验依据.

人参； 生物量； 组织形态； 代谢物； 酶活力； 活性成分

人参(PanaxginsengC.A.Mey)为五加科多年生草本植物[1]，其干燥的根是我国著名的传统中药材，素有“百草之王”的美誉.中国最早的药学典籍《神农百草经》就已经把人参列为上品，具有大补元气、安神益智、生津固脱、调补五脏、强精通脉和延缓衰老等功效[2].对于人参的质量评价方法，自古以来一直依靠“五行”(须、皮、芦、纹、体)和“六体”(灵、笨、老、嫩、棱、顺) 等外部形态来判断[3].并且我国1984年颁布的76种药材商品规格标准中也明确提到，中药材性状特征是评价中药材质量优劣的最直接方法.在2010年《中国药典》(一部)的规定中， 性状特征仍是中药材宏观质量评价的内容.然而，关于人参根组织形态与其内部生理生化活性成分的相关性却鲜有报道.因此，本实验通过对园参和不同年限林下参的生物量、根组织形态、代谢物含量和酶活力进行比较分析，阐述人参外部形态与其内在质量关系的科学内涵，为依据外部形态评价人参质量提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 15年生、20年生、25年生林下参采自于127°E、42°N，海拔500 m吉林省抚松县露水河镇吴杰野山参基地，采样时间2014年8月19日～8月21日.经基地总经理吴杰和长春中医药大学赵大庆教授共同鉴定，获得不同年限的林下参各15株.5年生成熟园参样品采购于吉林省抚松县(与林下参属于同一区域).

1.1.2 仪器与试剂 Leica RM2135切片机(德国Leica微系统有限公司)，Eppendorf 离心机5804R(德国Eppendorf股份公司)，UV765紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，JD200-3电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)，奥林巴斯显微镜CKX41(奥林巴斯株式会社)，正丁醇、无水乙醇(北京化工厂)，二甲苯、石蜡、番红(天津市福晨化学试剂厂)，固绿FCF(Regal Biotechnology Company)，树胶(国药集团化学试剂有限公司)，二硝基苯肼、甲醇、三氯乙酸(天津光夏精细化工研究所).

1.2 方法

1.2.1 人参生物量及比根重、比根长的统计 人参分割成芦头、主根、侧根3部分[4]，置于电子天平上称量各部分质量[5]，于坐标纸上测量各部分长度[6]，并计算各部分比根重(根重/根长)、比根长(根长/根重).

1.2.2 人参石蜡切片的制作 新鲜人参根制成6 μm石蜡切片，经番红-固绿双重染色后，用中性树胶制成永久切片[7]，显微镜观察并拍摄成像.

1.2.3 人参代谢物含量的测定 采用甲醇冷凝回流提取总皂苷[8]，紫外分光光度法于550 nm测定其含量.利用80%的乙醇提取淀粉[9]，利用紫外分光光度法于620 nm测定.用三氯乙酸提取丙酮酸[10]，应用二硝基苯肼法于520 nm测定其含量.用25%溴乙酰冰醋酸溶液中提取木质素[11]，于280 nm测定其含量.用10%三氯乙酸超声提取丙二醛(MDA)[12]，分别在600、532和450 nm波长下测定吸光度值并进行含量计算.

还原型抗坏血酸AsA和总抗坏血酸T-AsA用6%三氯乙酸提取[13]，紫外分光光度法于412 nm测定其含量，T-AsA减去AsA即得脱氢抗坏血酸(DHA).1.2.4人参能量代谢、抗氧化相关酶活力测定 能量代谢相关酶淀粉酶(AMY)和苹果酸脱氢酶(MDH)活力采用分光光度法，分别在540 nm和340 nm测定活力，ATP合酶活力用ELISA试剂盒测定.

抗氧化相关酶抗坏血酸过氧化氢酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)[14]和过氧化物酶(POD)活力采用分光光度法，分别于290 nm、325 nm和470 nm测定.1.2.5数据处理 各组指标采用统计软件SPSS16.0[15]进行分析，统计数据用均值±标准差表示.组件比较采用单因素方差分析比较各组指标的显著性差异，以P<0.05为差异显著.

2 结果

2.1 人参生物量的比较

对采摘的60株人参生物量(芦、须、根的长度和质量)进行统计分析，结果如表1所示.

表1 园参和不同年限林下参生物量

*：P<0.05表示与园参的各生物量有差异;#：P<0.05表示20年林下参与15年林下参有显著性差异;+：P<0.05表示25年林下参与20年林下参有显著性差异

如表1所示，园参的总重、主根重、须根重、比根重高于林下参，但比根长低于林下参；不同年限林下参的总重、主根重、须根重、比根重随年限增加，但比根长随年限减小；所有年限人参中，韧皮部与木质部比重、芦长与总长比值随年限增加，总长、主根长、须根长随年限而减小.

2.2 人参根组织形态学的比较

将人参制成石蜡切片(标尺=0.1 mm)，用显微镜(×40)观察园参和不同年限林下参的根组织形态学上的变化，如图1和表2所示.

观察切片显示，随着人参生长年限的增加，人参树脂道逐渐发达，环数和个数均增加；周皮木栓层细胞越来越扁平且排列日趋紧密、韧皮部裂隙出现，并不断增大，导管个数也逐渐增加.

图1 园参和不同年限林下参组织切片Fig.1 Tissue slice of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years

表2 园参和不同年限林下参组织结构比较

2.3 人参代谢物含量的比较

人参在生长过程中会产生多种代谢物，这些代谢物有些是人参的药用成分，如皂苷、蛋白；有些是储能物质，如淀粉；它们的含量在生长过程中也发生了显著地变化.

图2 园参和不同年限林下参代谢物的含量Fig.2 Metabolites content of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years

如图2所示，园参的淀粉、木质素、MDA含量高于林下参，但皂苷、丙酮酸含量和AsA/DHA比值则低于林下参；不同年限林下参中，皂苷、丙酮酸、MDA含量随年限增高，而淀粉、木质素含量和AsA/DHA随年限降低.

2.4 人参酶活力的比较

代谢物的产生离不开酶的参与.有些酶能调节人参的生长发育、有些能帮助对抗恶劣环境，故检测与人参能量代谢和抗氧化相关酶活力，图3为园参和不同年限林下参酶活力比较.

图3所示，园参AMY、ATP合酶活力高于林下参，MDH活力低于林下参，APX、POD、SOD活力略低于15年林下参；不同年限林下参中，AMY、ATP合酶、SOD活力逐渐降低，APX、POD活力逐渐降低并趋于稳定，MDH活力逐渐升高.

图3 园参和不同年限林下参酶活力Fig.3 Enzyme activity of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years．

3 讨论

通过对人参的生物量进行比较分析发现，园参的比根重高于林下参，可能由于园参是人工栽培的，阳光和水分充足且少病虫害，生长环境明显优于林下参而导致；但园参芦长低于林下参，可能由于芦头是人参生长年限的重要标志，故随年限而增长；在不同年限林下参中，比根重随年限增加，而比根长下降，也就是说根在逐年的增重增粗，其内部组织形态及物质合成代谢水平也必然会伴随着发生变化.人参中韧皮部重/木质部重的比值随生长年限而升高，这也许与韧皮部主要负责有机物(如糖、蛋白质)的运输与贮藏功能有关[16]，韧皮部所占重量的增加，说明在生长过程中人参的代谢活动越旺盛.

通过观察人参根组织形态学变化，发现随着人参生长年限的增加，周皮(木栓层细胞)、韧皮部、形成层、树脂道和导管都发生了变化.树脂道是植物分泌产生代谢物的重要组织[17]，可产生皂苷[18]、 淀粉、蛋白质及多种无机盐等，人参的分泌组织树脂道逐渐发达(环数和个数均增加)，预示着人参的活性成分合成增强.周皮和韧皮部是贮存代谢物的主要组织，树脂道分泌的代谢物主要贮存在此.人参树脂道、周皮和韧皮部随年限逐渐发达，周皮木栓层细胞越来越扁平且排列日趋紧密、韧皮部裂隙出现并不断增大[19]，与生物量中韧皮部与木质部比重逐渐增大相符.由此推测，随着年限的增加，人参活性成分的合成与代谢也随之增加.

为了进一步验证人参代谢活动与其组织形态学的关系，检测了人参的代谢产物及相关酶的变化.人参进行能量代谢的主要活性成分是淀粉和丙酮酸.淀粉是植物体内贮藏的高分子碳水化合物，可以分解供能，植物也能利用太阳光能合成淀粉来贮藏，园参生长环境优越，不需要消耗大量淀粉供能，使淀粉得以积累，所以园参淀粉含量高于林下参；而林下参随着生长年限增加而逐渐成熟，所需能量逐渐下降，使淀粉含量得以积累.丙酮酸作为三大营养物质代谢的枢纽物质，实验研究证实丙酮酸含量升高，意味着人参糖代谢、氨基酸代谢和次级代谢以及能量代谢等较为活跃.物质的代谢离不开相关酶的催化，故能量代谢也必与淀粉酶AMY、苹果酸脱氢酶MDH和ATP合酶紧密相关.AMY可分解淀粉氧化供能，为人参幼苗的组织形态形成和生长发育提供能源，经检测AMY活性下降说明人参降解淀粉的能力减弱，能量以淀粉的形式被贮存，这与淀粉含量检测结果相一致.MDH是调节三大营养物质代谢的重要酶，参与糖异生、氨基酸合成、脂肪酸氧化和氧化呼吸作用等代谢途径，在植物的生长发育和种子萌发、植株生长、果实发育成熟等方面起着重要作用，MDH活性升高并趋于稳定说明人参逐渐成熟，能量需求趋于稳定.ATP合酶是人参氧化呼吸代谢不可或缺的酶，人参随着生长趋于成熟稳定，故ATP合酶活力不再增加，反有缓慢下降趋势.随生长年限的增长，人参能量代谢逐渐增强与人参根形态学上的增粗增重、生理活动的物质合成能力呈正相关性[20].

随着人参生长年限的变化，能量代谢逐渐增强，能量及物质合成前体增加，也就必然伴随次生代谢的活跃.而人参皂苷等次生代谢物正是其有效活性成分.通过对人参总皂苷含量检测显示，发现园参皂苷含量略低于15年和20年林下参，不同年限林下参皂苷含量随年限而增加呈正相关.并且已有研究报道，皂苷多分布在周皮与韧皮部[21]，这与本研究结果相一致，人参生长过程中皂苷含量逐渐增加，同时周皮木栓层细胞日趋紧密，韧皮部裂隙增大、质量增加.也就是说皂苷含量的变化与组织结构的变化密切相关.

植物在生长发育或遭受逆境胁迫过程中，活性氧的产生和清除处于动态平衡状态.植物体内存在着一套负责清除活性氧的抗氧化系统，包括坏血酸(还原型抗坏血酸AsA、脱氢抗坏血酸DHA)等抗氧化剂和调节其代谢的酶类(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、抗坏血酸过氧化氢酶APX)等活性物质.这些活性物质成分含量的改变，直接反映植物的抗氧化能力.MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物衰老或遭受逆境伤害的程度.而SOD和POD是膜脂过氧化的酶促防御系统中重要的保护酶，可消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质(如MDA)，实验结果显示随生长年限增加，人参逐渐衰老，MDA含量不断升高，SOD和POD活性随之降低[22].二者呈负相关.AsA/DHA可反映抗氧化能力，APX是AsA循环的关键酶，实验结果显示AsA/DHA比值下降，并且APX活性与抗坏血酸变化趋势相近，说明人参随着生长成熟抗氧化能力逐渐降低.这也可能与人参生长成熟后其周皮木栓层细胞排列紧密，对外界刺激防御能力增强，活性氧产生下降有关.

4 结论

本实验通过对园参和不同年限林下参的生物量、根组织形态、代谢物含量和酶活性进行比较分析，发现园参和不同年限林下参的根组织形态存在差别，这种差别可能是由于人参内部代谢活动的变化所导致的.初步分析发现人参随能量代谢的增强及淀粉的贮备，导致根逐渐增粗增重；皂苷含量的变化与其周皮木栓层细胞和韧皮部裂隙的变化呈正相关性；抗氧化能力与周皮木栓层细胞的紧密性呈负相关.通过探讨人参根组织形态与生理生化活性成分之间的关系，为依据外部形态评价人参质量提供重要的实验依据.

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Study on the relevance between ginseng root tissue morphology and biologically active ingredients

WANG Manying， JIN Wenqi， GUO Haiyang， WANG Hongxiao， SUN Liwei

(College of Chemistry and Biology, Beihua University， Jilin, Jilin 132013)

In order to study the relevance between ginseng root morphology and biologically active ingredients, the morphology of ginseng was observed using safranin and fast green staining and the contents of metabolites. Activities of enzymes and the biomass of ginseng were measured by ELISA and spectrophotometry methods. Our results indicated that the root weight ratio of cultivated ginseng was higher than that of ginseng under forest. However, the resin channel, cork layer cells and phloem fissure of ginseng under forest were more developed than those of cultivated ginseng. The accumulations of ginsenosid, pyruvate and the activity of MDH were higher in ginseng under forest compared to cultivated ginseng. In addition, we found that as the ginseng ages increase, the resin channel, cork layer cells and phloem fissure were more developed and the accumulations of ginsenoside, starch, pyruvate and the activity of MDH were elevated. However, the root weight ratio and the accumulations of antioxidant metabolites and enzymes of ginseng decreased. At the same time, the energy metabolism, cork layer cells and phloem fissure became more developed. All of these might contribute to the growth and development of ginseng root. There existed a positive correlation between the content of ginsenoside and the developed degree of the cork layer cell and phloem fissure and the antioxidant ability was negatively correlated with the tightness of cork layer cells. Our results provided an experimental basis of the quality evaluation of ginseng according to its morphology.

ginseng; biomass; tissue morphology; metabolite; enzyme activity; biologically active ingredient

2015-01-20.

国家科技支撑计划项目(2012BAI29B05)；国家自然科学基金项目(81373932)；吉林省医药产业发展专项资金项目(YYZX201268).

1000-1190(2015)03-0428-06

Q946.91

A

*通讯联系人. E-mail: sunnylilwei@163.com.