香榧假种皮醇提物抑制植物病原菌活性及乳油制备初步研究

刘冰冰+李颖+樊佳祺+王国夫+孙小红

摘要：以乙醇作为提取剂制备香榧（Torreya grandis Merrilli）假种皮醇提物，并研究醇提物乳油制剂制备工艺。采用生长速率法测定醇提物及其乳油对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）5种植物源病原菌的抑菌效果。结果表明，香榧假种皮醇提物对番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌等5种植物源病原菌具有较强的抑菌效果，10 mg/mL时对5种病菌的抑制率都在40%以上;筛选出乳油的最佳配方为香榧假种皮醇提物14%、乳化剂（吐温-20）15%、溶剂（乙酸乙酯）71%，乳油对5种病菌的抑制率都在50%以上。可见香榧假种皮醇提物抑菌谱较广，值得进一步研究开发。

关键词：香榧（Torreya grandis Merrilli）假种皮;乙醇提取物;乳油制剂;抑菌活性;植物病原菌

中图分类号：S482.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0349-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.023

Antifungal Activities of Ethanol Extracts from Torreya grandis Merrilli Aril and  Preparation of Emulsifiable Concentrates

LIU Bin-bin，LI Ying，FAN Jia-qi，WANG Guo-fu，SUN Xiao-hong

（Yuanpei College，Shaoxing University，Shaoxing 312000，Zhejiang，China）

Abstract： The antifungal activities of ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril and its emulsifiable concentrates to Alternaria solani， Pyricularia oryzae， Bipolaris maydis，Pseudoperonospora cubensis，Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum were tested in vitro. The preparation of emulsifiable solution was studied. The results showed that ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had strong inhibitory effects on five phytopathogens， with the inhibiting rate of more than 40% at the concentration of 10 mg/mL. The optimal emulsifiable concentrates were ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril 14%， solvent（ethyl acetate） 71%， emulsifying agent （Tween-20）15%. The inhibitive rates of emulsifiable concentrates to five fungi were more than 50%. The ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had antifungal activities and were needed to be studied further.

Key words： Torreya grandis Merrilli aril; alcohol extract; emulsifiable concentrates; antifungal activity; phytopathogens

香榧（Torreya grandis Merrilli）为红豆杉科（紫杉科，Taxaceae）榧属（Torreya）常绿乔木，系裸子植物，是第三纪孑遗植物，又称细榧、木皮子、羊角榧等，为稀有坚果类树种，其果实香榧果具有食用和药用价值[1，2]。香榧果实一直备受青睐和肯定，但约占其种子鲜重50%～60%的假种皮部分则没有得到有效利用，长期被当作加工废弃物，不仅浪费资源，而且污染环境。

香榧假种皮富含多种活性物质，如黄酮类、二萜类、木脂素类化合物，还有醇、醛、烯、酚等植物芳香物质，某些物质还具有很强的抑菌活性，如木脂素类化合物、烯类化合物等。胡刘岩等[3]研究发现香榧壳挥发油含有大量的柠檬烯、蒎烯等具有抑菌作用的活性成分，这可能是其具有抑菌生物活性的原因。然而关于香榧假种皮提取物抑菌活性的研究报道较为鲜见。

植物病害是农业生产的大敌，而目前防治植物病害的主要手段为施用化学杀菌剂。由于化学农药有潜在危害，研制开发与推广应用安全、高效的生物农药已成为现代农药的主流。从植物中寻找抗菌活性物质是目前开发无公害农药的重要途径之一。本研究在测定香榧假种皮乙醇提取物抗菌活性的基础上，尝试将其制备成环保型乳油，旨在为创制和发展新型植物源农药提供参考。endprint

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  植物样品  香榧假种皮收集自浙江省绍兴市稽东镇香榧基地，经绍兴文理学院元培学院金自学教授鉴定为Torreya grandis Merrilli 的假种皮，置于阴凉通风处自然阴干。

1.1.2  供试菌种  黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）由山东省农业科学院提供。

1.2  测定方法

1.2.1  醇提物制备  将香榧假种皮用中药粉碎机粉碎，取200 g粉碎物于2 000 mL圆底烧瓶加70%乙醇1 000 mL回流提取2 h，过滤，取滤液旋转浓缩成浸膏，制成香榧假种皮醇提物，密封后于0～4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2  醇提物抑菌活性测定  采用菌丝生长速率法进行测定[4，5]。将香榧醇提物浸膏用少量二甲基亚砜溶解，用无菌水定容，配制成各浓度供试药液。在无菌条件下，将供试菌种用7 mm的打孔器打出一定数量的菌饼备用。熔化PDA培养基，用移液枪移取0.5 mL药液放入培养皿内，趁热倒入14.5 mL培养基于培养皿中制成厚薄均匀的平板，使培养基的药液最终浓度为2、4、6、8、10 mg/mL，以添加含有同样浓度的二甲基亚砜的无菌水为对照。每培养皿放置1个菌饼，菌丝面向下，重复3次，（28±1） ℃培养，72 h后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，评判醇提物抑菌活性。

菌落直径=菌落测量直径-菌饼直径;菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.2.3  醇提物乳油配方确定

1）溶剂筛选。为保证剂型环保，在乳油溶剂筛选中，弃用三苯类、芳烃类及氯仿等有毒溶剂，选择毒性相对较低的有机溶剂。取约10 mg的香榧假种皮醇提物浸膏，点于凹形载玻片的凹面内，再用移液枪吸取50 μL的溶剂点于浸膏的一侧，加盖玻片，观察扩散速度;室温静置1 h后，观察溶解情况。若没有完全溶解，再滴加10 μL溶剂，再观察，可逐次滴加溶剂，直至完全溶解。用20倍体视显微镜加以确认。为防止溶剂挥发，可用凡士林密封盖玻片。所用溶剂有丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇等。根据浸膏在溶剂中的扩散速度和溶解度，初步筛选出较佳溶剂。试验过程中，注意避免空气流动。

2）乳化剂筛选。弃用农乳系列，选择毒性相对较低的乳化剂。以醇提物浸膏280 mg，以溶剂筛选确定的溶剂2 mL为基础，进行乳化剂筛选。观察所配制剂的外观，以能形成均相透明、乳化性能好的乳化剂入选。

3）乳油稳定性检测。在250 mL烧杯中，加入10 mL （30±2） ℃标准硬水（氯化钙0.304 g、六水氯化镁0.139 g，以蒸馏水定容至1 000 mL）。用移液管吸取适量乳油试样，在不断搅拌的情况下慢慢加入硬水中，配成100 mL乳状液。2～3 r/s搅拌30 s，将乳状液移到清洁、干燥的100 mL量筒中，（30±2） ℃恒温静置水浴1 h，观察乳状液分离情况。量筒中无浮油（膏）、沉油和沉淀析出，则判定乳油稳定性合格[4]。

4）乳油分散性检测。将装有500 mL标准硬水的大烧杯置于25 ℃的恒温水浴中，温度平衡后用移液管吸取l mL乳油，离液面1 cm滴下，观察分散性。如能迅速地自动分散，水体变为乳白色透明状，则认为其扩散完全，判定乳油分散性合格。

1.2.4  乳油抑菌活性测定  按最佳配方配制香榧假种皮醇提物乳油，测定其对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用[6]，测定方法同“1.2.2”。

2  结果与分析

2.1   醇提物对植物病原菌的抑制作用

不同浓度的香榧假种皮醇提物对5种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定程度的抑制作用（表1），说明其抗菌谱较广。其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，抑制率均在62%以上，在醇提物浓度为10 mg/mL时抑制率最大，为79.57%。对水稻稻瘟病菌和黄瓜霜霉病菌菌丝生长最大抑制效果相近，其中，对水稻稻瘟病菌菌丝生长抑制效果随醇提物浓度增加而明显增加，在最大浓度10 mg/mL时，抑制效果最佳，抑制率为68.97%;对黄瓜霜霉病菌菌丝生长抑制效果随醇提物浓度增加变化不明显。对玉米小斑病菌，在10 mg/mL和6 mg/mL时的抑制率分别为56.08%和53.83%，2 mg/mL时抑制率在50%以下;对于番茄早疫病菌，抑制率均在50%以下，抑菌效果较差。

2.2  醇提物乳油配方筛选结果

香榧假种皮醇提物在各溶剂中扩散速度从快到慢依次为乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、无水甲醇，溶解度分别为0.14 mg/μL（乙酸乙酯）、0.11 mg/μL（丙酮）、0.07 mg/μL（无水乙醇），0.06 mg/μL（无水甲醇），筛选得到的最佳溶剂为乙酸乙酯。以乙酸乙酯为溶剂进行乳化剂筛选（表2），最终筛选出的最佳乳油配方为醇提物14%、乳化剂（吐温-20）15%，溶剂（乙酸乙酯）71%。

2.3  醇提物乳油对植物病原菌的抑制作用

香榧假种皮醇提物乳油对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用测定结果（表3）表明，10 mg/mL香榧假种皮醇提物乳油对5种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定程度的抑制作用。其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，抑制率为85.70%;对黄瓜霜霉病菌、番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、水稻稻瘟病菌的菌丝生长抑制率分别为71.92%、50.46%、59.02%、74.49%，其抑菌效果优于醇提物。endprint

3   小结与讨论

长期以来，香榧假种皮作为废物丢弃，既浪费了资源，又造成了环境的污染。已有研究表明，香榧假种皮富含多种活性成分，具有抑菌以及杀虫生物活性[7，8]。对香榧假种皮采用70%乙醇回流提取活性成分，得到乙醇浸膏，制成不同浓度的溶液，并对其抑菌活性进行了测试。结果表明，不同浓度的醇提物对各供试菌菌丝生长的抑制活性普遍较高，其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，各浓度抑制率均在62%以上。可见，香榧假种皮醇提物抑菌谱较广，且活性较强，具有较好的开发应用前景。同时也证实香榧假种皮含有抑菌活性化合物，具体成分和作用机理有待深入研究。

乳油是农药传统基本剂型之一，与其他农药剂型相比，乳油有效成分含量较高、贮存稳定性好、工艺简单，至今依然是国内和发展中国家主要使用的农药剂型。但由于有机溶剂用量大，容易污染环境，使用率有所下降。选择使用环境友好、生物降解性好、低刺激、高效率的绿色表面活性剂应用于乳油生产，有助于降低助剂对环境、农产品安全的潜在威胁[9]。本研究对香榧假种皮醇提物浸膏分别通过溶剂和乳化剂的筛选、乳油稳定性和分散性的测定，确定最佳配方，制备乳油对其抑菌活性进行测试。结果表明，香榧假种皮醇提物乳油在一定浓度（10 mg/mL）下，对5种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用， 且菌丝生长抑制率均高于醇提物。可见， 相同提取物含量的乳油抑菌效果更好。这与田秀玲[10]报道的蛇床子乳油比提取液药效高的结论相符。在开发新型植物源杀菌剂方面，香榧假种皮醇提物具有较大的潜力， 可对其进行深入研究。

参考文献：

[1] 王向阳，修丽丽.香榧的营养和功能成分综述[J].食品研究与开发，2005，26（2）：20-22.

[2] 孟鸿飞，金国龙，翁仲源.诸暨市香榧古树资源调查[J].浙江林学院学报，2003，20（2）：134-136.

[3] 胡刘岩，戴妙妙，张赟彬.香榧壳挥发油的提取工艺及抗菌性研究[J].食品工业，2011（9）：74-76.

[4] 王树桐，张凤巧，高瑞平，等.126种中草药提取物对2种植物病原真菌的抑制作用[J].河南农业科学，2006（10）：62-65.

[5] 周  琳，焦  斌，高  飞，等.旋覆花花序不同溶剂萃取物对植物病原真菌的抑菌活性[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2010，36（3）：287-292.

[6] ROMAGNOLI C， BRUNI R， ANDREOTTI E， et al. Chemical characterization and antifungal activity of essential oil of capitula from wild Indian Tagetes patulal[J]. Protoplasma，2005，225：57-65.

[7] 王  鸿，郭  涛，应国清.榧属植物活性成分与药理作用研究进展[J].中草药，2007，38（11）：1747-1750.

[8] 单麟珉，孙小红.香榧假种皮提取物对潜叶跳甲的杀虫活性初步研究[J].湖北农业科学，2013，52（9）：2060-2062.

[9] 裴  琛，沈德隆，杜  廷.浅谈对传统农药制剂乳油的改进研究[J].浙江化工，2010，41（3）：11-15.

[10] 田秀玲.植物源杀菌剂——蛇床子乳油的研制[D].沈阳：沈阳农业大学，2003.endprint