酶催化氧化法处理水中的己烯雌酚

李洪枚

摘要：研究用辣根过氧化物酶（HRP）催化氧化法处理水中己烯雌酚（DES）的适宜工艺反应条件。试验考察了反应温度、pH和反应物反应计量比等对DES去除率的影响。结果显示，在pH4.5、25 ℃、[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol和MH■O■∶MDES（反应摩尔比）为1∶2的反应条件下，反应3 h，DES去除率可达到92.08%。研究表明，HRP催化H2O2氧化DES反应的适宜条件是：pH4.5左右，温度25 ℃左右，[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol，MH■O■：MDES宜大于0.5;过量H2O2抑制HRP催化活性;DES起始浓度越高，其去除速率越大;以底物DES去除速率表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为74.63 mmol/（L·h）和46.75 mmol/L。

关键词：酶催化氧化;处理;己烯雌酚

中图分类号：X131;TQ426.97        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0331-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.019

Enzyme-Catalyzed Oxidation of Diethylibestrol in Aqueous Phase

LI Hong-mei

（School of Safety and Environmental Engineering， Capital University of Economics and Business， Beijing 100070， China）

Abstract： Conditions for the horseradish peroxidase （HRP） catalyzed oxidation of diethylibestrol （DES） in aqueous phase were studied. The effects of pH， reaction temperature and mole ratio of reactants on the removal of DES were determined. 92.08% of DES was oxidized under the condition of pH4.5， 25 ℃， 1.000 U/μmol ratio of HRP to DES，MH■O■∶MDES （mole ratio） =1∶2 and reaction time of 3 h. The optimal conditions for the oxidation of DES catalyzed by HRP were pH 4.5， 25 ℃，1.000 U/μmol ratio of HRP to DES and more than 0.5 mole ratio of MH■O■：MDES. Overdose of H2O2 inhibited the catalization activity of HRP. With the increase of initial concentration of DES， reaction rate was increased. The maximum rate （Vmax） and Michaelis constant （Km） of enzyme were 74.63 mmol/（L·h） and 46.75 mmol/L， respectively. The reaction rate was expressed in terms of DES removal per hour.

Key words： enzyme-catalyzed oxidation; disposal; diethylibestrol

己烯雌酚（diethylibestrol，DES）是一种人工合成的药用非甾体雌激素，与天然雌激素雌二醇有相同的功效，主要用于治疗雌激素低下症等疾病，部分女性保健品和化妆品中也含有一定量的DES[1]。DES是一种生物活性很强的环境激素，水体中微量DES可诱导雄鱼体内卵黄蛋白原明显升高，具有很强的内分泌干扰能力[2]。有研究显示孕妇吸收DES，其男孙代出现尿道下裂几率高[3]。DES还可引起基因突变而诱发癌症[4-6]，长期食用含微量DES的食品可导致儿童性早熟、男性精子畸形和雌性化等危害[7，8]。因此，国内外对DES作为药物使用进行了严格限制，尤其是禁止将DES用作饲料添加剂[9]。遗憾的是，我国部分畜禽养殖企业为提高畜禽产量，违法在饲料中添加DES，导致禽蛋和肉类食品中DES残留量高达0.2～10.0 mg/kg，存在极大的健康隐患[10，11]。环境中的DES主要来自药品生产企业、医院、养殖企业和居民生活等产生的污水[12]， 报道显示我国部分地区地表水中DES的浓度达到6 ng/L[13]，部分城市的污水处理厂出水中DES的浓度为0.3～6.2 ng/L[14，15]。西班牙有关污水处理厂排出水中DES浓度为34 ng/L[16]。可见，现有污水处理工艺还不能有效去除水中DES。而国内外仅有几篇用光催化氧化法处理水体中DES的研究报道[17-21]， 相关研究很少。酶催化氧化处理废水中有机污染物以其反应条件温和、反应快和选择性好等优点而受到广泛关注，本研究选用辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）催化H2O2氧化水中微量DES，试验考察反应温度、pH、H2O2和DES初始浓度等反应条件对HRP催化氧化DES过程的影响，得到适宜的反应工艺参数，为进一步建立HRP处理实践中含DES废水新技术提供依据。endprint

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

Agilgent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， 色谱柱为Beckman Ultrasphere ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Cary 50型紫外可见分光光度计（美国瓦里安公司），LY-1000型恒温培养振荡器（江苏金坛市亿通电子有限公司），PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），SKY-100C型恒温培养振荡器（上海苏坤实业有限公司），单道可调式移液器（德国Eppendorf公司，两种规格：10～200 μL和100～1 000 μL），FA2004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），10 mL带有刻度的棕色避光瓶。

试验用试剂从Sigma-Aldrich公司购买，包括色谱纯试剂己烯雌酚、甲醇、乙腈和2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS），分析纯试剂双氧水（30%H2O2）、磷酸二氢钾、正磷酸（85%H3PO4）、冰乙酸、硼酸、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、氢氧化钾和氢氧化钠，生化试剂辣根过氧化物酶（HRP，250～330 U/mg）、过氧化氢酶（2 000～5 000 U/mg）和牛血清白蛋白（纯度大于98%），去离子水（Hitech-Sciencetool超纯水系统制备）。

1.2  试验方法

1.2.1  溶液的配制  DES标准贮备溶液：准确称量2.5 mg DES，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容备用（注：DES在水中几乎不溶，故用甲醇配制），浓度为0.093 27 mmol/L。考虑到酶促反应速度快及其与工业废水中DES浓度的相近程度，本试验采用DES初始浓度为0.037 3 mmol/L。

HRP溶液：准确称取1 mg HRP溶于250 mL去离子水中，再用单道可调式移液器移取1 mL HRP溶液于100 mL容量瓶中用去离子水定容，测得其活性为0.624 8 U/mL，置于4 ℃避光条件下保存待用， 保存时间不超过1周。

H2O2溶液：含30%H2O2的双氧水，密度为1.122 g/cm3。取1 mL双氧水于100 mL容量瓶中用去离子水定容，再从100 mL H2O2溶液中取1 mL于50 mL容量瓶中定容，此时配得的H2O2溶液浓度为1.96 mmol/L，4 ℃避光保存。H2O2溶液在使用之前配制。

过氧化氢酶溶液：准确称取0.531 4 mg过氧化氢酶溶于去离子水中配成10 mL溶液， 测得其活性约为170 U/mL[22]， 过氧化氢酶溶液在使用之前配制。

Britton-Robinson缓冲溶液配制方法参考文献[23]。

1.2.2  反应体系的建立  反应在10 mL带有刻度的棕色避光瓶中进行。首先通过计算确定好10 mL反应混合液中各组成部分所需要的量（体积），然后用单道可调式移液器依次移取一定量的DES标准储备溶液和HRP溶液至避光瓶中，再加入Britton-Robinson缓冲溶液，置于恒温振荡器中孵育15 min，最后加入H2O2溶液，使反应混合液总体积为10 mL。盖好避光瓶，并置于恒温培养振荡器中振荡（150 r/min）。定时取样，并加入一定量过氧化氢酶使H2O2分解而终止反应（可直接在离心管中进行）[24]。将样品离心10 min，移取上清液，分析DES残留浓度，计算DES去除率。

1.2.2  分析方法  DES浓度测定：用HPLC法，色谱条件是：色谱柱为Beckman UltraspHere ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇和水（70∶30，V/V），流速和进样体积分别为1.0 mL/min和5 μL，检测波长为240 nm，停留时间6.0 min，DES检测的标准方程：峰面积=9 891.6CDES-6.106 2，R2=0.998 6。每次检测做3个平行样品，误差小于5%。每次样品测量前都采用外标法确定DES校准曲线方程，再确定未知样DES浓度。

HRP活性测定采用ABTS法[25]。

2  结果与分析

2.1  pH对DES去除效果的影响

试验测量了不同pH条件下DES的去除率，考察反应体系pH变化对HRP催化氧化DES过程的影响。反应起始条件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性为0.037 3 U/mL，反应温度为25 ℃，反应时间为60 min，反应体系的pH分别为3.16、3.98、4.51、4.90、6.00、7.00、8.08和9.03。结果如图1所示。

由图1可以看出，DES的去除率随pH的增加呈钟型变化，即在3.16～9.03范围内，DES去除率随pH增加先升高后降低;pH为4.51时，DES的去除率达到最高值93.62%;pH小于3.16或大于9.03时，DES去除率比较低，HRP催化活性受到限制。试验结果表明，HRP能在一个比较宽的pH范围内催化氧化DES，适宜pH为4.51。

HRP能在pH4.00～11.00范围内催化底物反应，因底物不同存在差异，催化多数底物反应的适宜pH在7.00左右，pH小于4.00或大于11.00时，HRP催化活性很低[26，27]。但也有研究报道HRP催化H2O2氧化五氯代酚的适宜pH范围为4.00～5.00[28]，与本研究结果比较相近。因此，以下试验均选择pH为4.50的缓冲溶液作为酶促反应介质，以保持HRP催化活性的相对稳定。

2.2  温度对DES去除率的影响endprint

反应起始条件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性为0.037 3 U/mL，pH为4.50，反应时间为30 min，反应体系的温度分别为15、20、25、30、35和40 ℃。结果如图2所示。

由图2可以看出，DES去除率随着反应体系温度的升高而逐渐升高，当温度超过35 ℃时，去除率急剧下降;反应温度为25 ℃时，DES去除率达到最大值90.13%;温度在15 ～35 ℃范围内时，DES去除率均在80%以上。因此，HRP能在较宽的温度范围内催化氧化DES，适宜温度为25 ℃。温度对酶催化反应的影响表现在两个方面：一是随着温度升高，酶促反应活化分子增加，反应速率增大;二是反应温度升高到一定值后，酶蛋白会发生变性，失去催化活性，导致酶促反应速率下降。这两种相反效应使得酶促反应存在一个适宜的温度范围。试验结果表明，温度超过35 ℃时，HRP催化活性明显减弱，DES去除率仅为47%。研究HRP适宜的催化反应温度，有助于保护HRP的催化活性，提高DES去除率。

2.3  HRP与DES用量之比对DES去除率的影晌

酶的用量直接影响其工程应用成本，考察HRP用量对DES去除率的影响，选择最适宜的HRP用量（[HRP]0表示酶起始用量，U/mL），对降低工程应用成本具有重要作用。反应起始条件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，pH为4.50，反应温度为25 ℃，[HRP]0/[DES]0起始比分别为0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 U/μmol，反应时间分别为30和180 min。结果如图3所示。

由图3可以看出，随着[HRP]0 /[DES]0增大， 即随着HRP起始用量增加，DES去除率升高。当[HRP]0 /[DES]0分别为0.250、0.5.00、1.000和2.000 U/μmol，反应180 min后，DES去除率分别为89.81%、90.67%、92.08%和90.51%， DES去除率相差比较小，表明[HRP]0 /[DES]0达到一定量后，能够满足底物去除要求，过多的酶对反应没有催化作用。[HRP]0/[DES]0小于0.25 U/μmol时，DES去除率比较小，表明酶量不足。综合考虑反应速度和HRP催化活性随反应过程进行而减弱等因素，宜选择[HRP]0/[DES]0=1.000 U/μmol作为反应体系中HRP与DES的最佳配比。

2.4  H2O2浓度对DES去除率的影晌

如果仅考虑H2O2与DES发生的氧化还原反应， 那么提高H2O2浓度，会加快反应速度，增大DES去除率。但过量的H2O2容易使HRP失去催化活性[20]。因此，必须综合考虑HRP催化活性和DES的去除率，选择适宜的H2O2用量。本试验在其他条件一定的情况下，通过改变H2O2浓度考察H2O2用量对DES去除率的影晌。反应起始条件是：[DES]0=0.037 30 mmol/L，HRP起始活性为0.037 30 U/mL，pH为4.50，温度为25 ℃，H2O2的浓度分别为0.004 66、0.009 32、0.018 65、0.037 30、0.074 60、0.149 20和0.298 40 mmol/L。结果如图4所示。

由图4可以看出，当H2O2浓度比较低时，如0.004 66和0.009 32 mmol/L，反应2 h，DES去除率小于70%，且反应速率（曲线的斜率）小，表明H2O2 浓度低，反应速率小，不能将DES全部氧化;当H2O2浓度处于0.018 65～0.074 60 mmol/L范围内时，反应2 h，DES去除率达到90%以上，反应速率大;H2O2浓度为0.074 60 mmol/L时，DES去除率达到最大值92.57%;当H2O2浓度达到0.149 20 mmol/L时，反应2 h后，DES去除率小于80%，表明H2O2浓度过高，对HRP催化氧化DES过程有明显的抑制作用，原因是过量H2O2与反应中间产物HRP-II进一步作用生成一种没有催化能力的副产物HRP-Ⅲ[29]，从而降低DES的去除率。进一步用H2O2与DES的反应摩尔比进行分析，数据处理结果参见图5。图5是反应2 h后，DES去除率随MH■O■∶MDES的变化曲线。

由图5可以看出，MH■O■：MDES为1/8～2时，反应2 h后，DES去除率从60.13%上升到92.57%，DES去除率随MH■O■∶MDES增大而增大;当MH■O■∶MDES为4时，DES去除率下降明显，过量H2O2抑制了HRP催化反应过程。理论上讲，HRP催化氧化1 mol DES，只需要0.5 mol H2O2，即MH■O■∶MDES为0.5时，DES去除率应达到最大[21]，但反应2 h，MH■O■∶MDES为0.5～2.0时，DES去除率分别为90.01%、91.05%和92.75%。显然，其他条件一定时，要完全氧化1 mol DES，MH■O■∶MDES需大于0.5。有关HRP催化H2O2氧化酚类底物的研究报道显示，MH■O■：M底物因底物不同比值可以为0.5[30]、1.0[31]和1.6[32]。反应消耗较多的H2O2，可能是由于底物氧化产物如二聚体小分子进一步被HRP催化氧化而增大了H2O2用量，使得H2O2用量高于理论用量[33]。

2.5  DES起始浓度对去除速率的影晌

本试验通过测量反应初始30 min内DES去除速率（用30 min内DES浓度变化除以30 min得到的平均反应速率， 即去除速率）， 考察DES起始浓度对去除速率的影响，即对单位时间内DES浓度变化率的影响。反应初始条件是[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性为0.037 30 U/mL， pH为4.5，温度为25 ℃。DES初始浓度分别为0.018 70、0.027 80、0.037 30 、0.046 60和0.056 00 mmol/L，反应时间为30 min。结果如图6所示。endprint

由图6可以看出，在反应的最初30 min内，DES去除速率随其起始浓度的增大而增大。原因是HRP催化H2O2氧化底物的4个反应步骤中， DES参与了其中的两个反应， DES浓度高，反应速率快，DES去除速率增大[34]。当DES起始浓度大于0.037 30 mmol/L时，DES去除速率增加幅度开始减小，表明酶催化初始反应速率受HRP量的限制，过多的DES对反应速率影响很小。进一步用双倒数法（浓度倒数和速率倒数）处理实验数据，可得到以底物DES表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km，■=■■+■（图7），V是DES去除速率（30 min内的DES平均去除速率），单位为mmol/（L·h）。可以求出Vmax=74.63 mmol/（L·h），Km=46.75 mmol/L。本试验结果得到Km值比HRP催化17β-雌二醇等雌激素反应的米氏常数大[35]，原因可能是本数据处理使用30 min内的平均速率代替初始反应速率，存在一定的误差。当然，底物不同，同一种酶催化底物反应的Vmax和Km也不同。

3  结论

试验得出以下结论：

1）HRP 催化H2O2氧化DES的适宜pH为4.51。

2）HRP催化H2O2氧化DES的适宜温度为25 ℃。

3）DES去除率随[HRP]0/[DES]0增大而升高。当[HRP]0/[DES]0大于0.5 U/μmol时， DES去除率超过90%。[HRP]0/[DES]0的适宜比值为1.000 U/μmol。

4）HRP催化H2O2氧化DES的MH■O■∶MDES宜大于0.5，以确保DES的去除率达到100%。H2O2用量过高，会抑制HRP催化活性，不利于DES的去除。

5）DES起始浓度越高，其去除速率越大。以底物DES表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为74.63 mmol/（L·h）和46.75 mmol/L。

参考文献：

[1] 叶  超，刘燕群，游  浩.武汉地区水中环境内分泌干扰物的污染情况及其对人体的影响[J].职业与健康，2013，29（7）：880-882.

[2] ZHONG X，XU Y，LIANG Y，et al.The Chinese rare minnow （Gobiocypris rarus） as an in vivo model for endocrine disruption in freshwater teleosts：A full life-cycle test with diethylstilbestrol[J]. Aquatic Toxicology，2005，71（1）： 85-95.

[3] KALFA N，PARIS F，SOYER-GOBILLARD M，et al.Prevalence of hypospadias in grandsons of women exposed to diethylstilbestrol during pregnancy：A multigenerational national cohort study[J]. Fertility and Sterility，2011，95（8）：2574-2577.

[4] SATO K，FUKATA H，KOGO Y，et al.Neonatal exposure to diethylstilbestrol alters expression of DNA methyltransferases and methylation of genomic DNA in the mouse uterus[J]. Endocrine Journal，2009，56（1）：131-139.

[5] VERLOOP J，VAN-LEEUWEN F，HELMERHORST T，et al.Cancer risk in DES daughters[J].Cancer Causes and Control，2010，21（7）：999-1007.

[6] ADAMI H，LAGIOU P，TRICHOPOULOS D.Breast cancer following diethylstilbestrol exposure in utero：Insights from a tragedy[J].European Journal of Epidemiology，2012，27（1）：1-3.

[7] MCLACHLAN J，NEWBOLD R，BULLOCK B.Reproductive tract lesions in male mice exposed prenatally to diethylstilbestrol[J].Science，1975，190（4218）：991-992.

[8] COLBRON T，VOM-SAAL F，SOTO A.Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans[J]. Environ Health Perspect，1993，101（5）：378-384.

[9] 张  霞，冯精兰，吴  峰，等.水溶液中己烯雌酚的臭氧氧化研究[J].河南师范大学学报（自然科学版），2010，38（2）：117-119.

[10] 陈杏琴，任永红，刘俊荣，等.石家庄市鸡肉中己烯雌酚含量调查与分析[J].中华预防医学杂志，2000，34（6）： 332.

[11] 杨冰仪，莫金垣，赖  瑢.肉类中己烯雌酚的高速毛细管电泳安培法测定[J].分析测试学报，2003，22（3）：15-18.endprint

[12] 王  辉.济南地区不同水体中环境激素含量测定及生物学效应研究[D].济南：山东师范大学，2010.

[13] 邵晓玲，马  军.松花江水中13种内分泌干扰物的初步调查[J].环境科学学报，2008，28（9）：1910-1915.

[14] 金士威，徐  盈，惠  阳，等.污水中8 种雌激素化合物的定量测定[J].中国给水排水，2005，21（12）：94-97.

[15] 贾  宁.北京市典型行业废水中14种环境雌激素的分析测定[D].北京：北京工业大学，2006.

[16] SOLE M，LOPEZ-DE-ALDA M，CASTILLO M，et al.Estrogenicity determination in sewage treatment plants and surface waters from the Catalonian area （NE Spain）[J].Environmental Science & Technology，2000，34（24）：5076-5083.

[17] ZHOU D，WU F，DENG N.Fe（III）-oxalate complexes induced photooxidation of diethylstilbestrol in water[J]. Chemophere，2004，57（4）：283-291.

[18] 游  春，王红丽，李培霞，等.水中己烯雌酚的紫外光降解[J].水处理技术，2006，32（4）：46-48.

[19] ABDERRAZIK N B， AZMANI A， R'KIEK C，et al.Iron（II）-catalyzed enhancement of ultrasonic-induced degradation of diethylstilbestrol（DES）[J]. Catalysis Today，2005，101：369-373.

[20] DOU D Y，LIU Y B，ZHAO H W，et al.Radiolysis and photolysis studies on active transient species of diethylstilbestrol[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry，2005，171： 209-214.

[21] 肖举强，王友玲.Cu2O光催化降解水中环境内分泌干扰物己烯雌酚性能的研究[J].净水技术，2008，27（2）：7-9.

[22] STELLMACH B.酶的测定方法[M].钱嘉渊，译.北京：中国轻工业出版社，1992.186-188.

[23] 杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册（第二分册）[M].北京：化学工业出版社，1982.16-29.

[24] PUTTER J，BECKER R. Methods of Enzymatic Analysis（Vol. III）[M]. Deerfield Beach，FL：Verlug Chemie，1983.286-293.

[25] KHAN U，NICELL J A.Horseradish peroxidase-catalysed oxidation of aqueous natural and synthetic oestrogens[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2007，82（9）：818-830.

[26] WU Y，TAYLOR K E，BISWAS N，et al.Comparison of additives in the removal of phenolic compounds by peroxidase-catalyzed polymerization[J]. Water Research，1997，31（11）：2699-2704.

[27] AURIOL M， FILALI-MEKNASSI Y，ADAMS C D，et al.Natural and synthetic hormone removal using the horseradish peroxidase enzyme：Temperature and pH effects[J]. Water Research，2006， 40：2847-2856.

[28] ZHANG G， NICELL J A.Treatment of aqueous pentachlorophenol by horseradish peroxidase and hydrogen peroxide[J]. Water Research，2000，34（5）：1629-1637.

[29] BERGLUND G I，CARLSSON G H，SMITH A T，et al.The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution[J].Nature， 2002， 417（6887）：463-468.

[30] HEWSON W D，DUNFORD H B.Stoichiometry of the reaction between horseradish peroxidase and p-cresol[J]. Journal of Biulogical Chemistry，1976， 251（19）：6043-6052.endprint

[31] NICELL J A，BEWTRA J K，TAYLOR K E，et al.Enzyme catalyzed polymerization and precipitation of aromatic compounds from wastewater[J]. Water Science and Technology，1992，  25（3）：157-164.

[32] DUARTE-VAAZQUEZ M A，ORTEGA-TOVAR M A，GARCIA-ALMENDAREZ B E，et al. Removal of aqueous phenolic compounds from a model system by oxidative polymerization with turnip （Brassica napus L var purple top white globe） peroxidase[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2002， 78（1）：42-47.

[33] SAKUYAMA H， ENDO Y， FUJIMOTO K， et al. Oxidative degradation of alkylphenols by horseradish peroxidase[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，96（3）：227-231.

[34] 叶  鹏，张剑波，陈  嵩，等.固定化辣根过氧化物酶催化去除五氯酚[J].北京大学学报（自然科学版），2005，41（6）：918-925.

[35] AURIOL M，FILALI-MEKNASSI Y，ADAMS C D，et al.Removal of estrogenic activity of natural and synthetic hormones from a municipal wastewater：Efficiency of horseradish peroxidase and laccase from trametes versicolor[J]. Chemosphere，2008，    70（3）：445-452.endprint