马铃薯渣酶解液发酵L-赖氨酸的优化

范瑞杰，张安红，徐庆阳

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏 银川，750021）

马铃薯渣酶解液发酵L-赖氨酸的优化

范瑞杰1，2，张安红2，徐庆阳1

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏 银川，750021）

以马铃薯渣酶解浓缩液为碳源，黄色短杆菌为发酵菌株，利用响应面法，分析了总糖（马铃薯渣酶解浓缩液添加量）、硫酸铵和玉米浆优化培养基的最佳组成，进而研究了生物素和二甲基亚砜的最佳用量。最终确定最佳发酵培养基：总糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米浆18.17 m L/L，生物素180μg/L，二甲基亚砜18 m L/L，且在发酵18 h时添加二甲基亚砜较佳，L-赖氨酸产量达到64.99 g/L，说明马铃薯渣可以作为发酵L-赖氨酸的原料。

马铃薯渣；L-赖氨酸；发酵

赖氨酸（L-Lysine），学名α，ε-二氨基己酸或2，6-二氨基己酸，存在L型和D型两种同分异构体，其中只有L-赖氨酸才具有生理活性，属于人和动物自身不能合成的8种必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸在谷物中缺乏最多，又被定义为谷物中的“第一限制性氨基酸”［1-2］。L-赖氨酸广泛用于食品和饲料行业，并且随着科学的发展，L-赖氨酸及其衍生物的医学功能也逐渐被发现［3］。目前赖基酸主要依靠发酵方法生产，发酵原料主要为玉米淀粉。近两年玉米价格的上升导致玉米淀粉价格攀升，赖氨酸的市场形势并不乐观［4］，因此有必要寻找新的廉价碳源来代替玉米淀粉。

马铃薯渣除了制备果胶、膳食纤维和单细胞蛋白外，由于其淀粉、纤维素和果胶含量都很高，在发酵行业中的应用也十分广泛，已应用于乙醇、柠檬酸、木聚糖酶等的生产方面［5-7］。但马铃薯渣在氨基酸发酵方面的应用尚未见报道，本文以马铃薯渣酶水解液为碳源，研究了马铃薯渣水解液作为碳源发酵产L-赖氨酸的可行性，充分利用了马铃薯渣，节省了资源。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄色短杆菌TY（Brevibacterium flavum），宁夏伊品生物科技股份有限公司赖氨酸生产菌种。

1.2 主要仪器

L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；SBA生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；UV-2000紫外分光光度计，尤尼柯仪器有限公司。

1.3 主要试剂

马铃薯渣酶解浓缩液、玉米浆均由宁夏伊品生物科技股份有限公司提供，其中马铃薯渣酶解浓缩液总糖含量为200 g/L左右，还原糖浓度为160 g/L左右。L-赖氨酸标准溶液（2.5mmol/L），购自日本日立公司；琼脂条、蛋白胨、酵母膏、生物素、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、苯酚红、无水葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3等均为国产分析纯。

1.4 培养基

1.4.1 活化培养基

蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂条15.0 g/L，pH 7.0～7.2，121℃条件下灭菌15 min。

1.4.2 种子培养基

葡萄糖20.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，玉米浆15.0 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 1 mg/L，生物素100μg/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min。

1.4.3 发酵培养基［8］

KH2PO44.0 g/L，玉米浆20.0 mL/L，CaCO35.0 g/L，(NH4)2SO420 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L， FeSO4·7H2O 0.01 g/L，生物素150μg/L，添加马铃薯渣酶解浓缩液，使培养基总糖含量为120 g/L，调节pH 7.0～7.2，121℃灭菌15min。

1.5实验方法

1.5.1 菌种活化

取斜面保藏菌种划线接种到斜面活化培养基上，30℃恒温培养24 h左右。

1.5.2 种子培养

接一环生长良好的斜面种子至装有30 mL种子培养基的500mL摇瓶中，9层纱布封口，220 r/min、30℃振荡培养24 h。

1.5.3 发酵培养

取上述种子培养液以10%（V/V）接种量接到装有45 mL发酵培养基的1 000 mL三角瓶中，9层纱布封口，220 r/min、30℃振荡培养72 h。发酵过程中不断补加浓氨水以增加氮源来维持稳定的pH值。同时根据每隔一段时间测得的残糖量来判断加糖量，补加一定浓度的马铃薯酶解浓缩液提供充足碳源，从而确保菌体的正常生长。摇瓶发酵时加入两滴2.0%的苯酚红作为发酵指示剂。

1.5.4 L-赖氨酸的发酵条件单因素实验［9-10］

在培养基初始总糖为120 g/L，玉米浆浓度为20.0 mL/L，(NH4)2SO4浓度为20 g/L的基础上，控制变量，分别设置不同单因素水平，培养基总糖浓度为100、120、140、160、180 g/L，玉米浆浓度8、13、18、23、28 mL/L，(NH4)2SO4浓度15、20、25、30、35 g/L，其他同1.4.3发酵培养基，进行单因素试验，确定总糖、玉米浆和(NH4)2SO4合适浓度。

1.5.5 响应面法优化发酵培养条件

在单因素试验结果的基础上，采用3因素3水平的Box-Behnken Design（BBD）响应面试验设计法，以总糖初始浓度、(NH4)2SO4初始浓度和玉米浆浓度为考察因素，以L-赖氨酸的产量（g/L）为指标进行优化。

1.5.6 生物素和二甲基亚砜浓度的确定［8，11］

在最佳培养基的基础上，分别控制生物素浓度90、120、150、180、210μg/L，二甲基亚砜浓度12、15、18、21、24 mL/L，检测赖氨酸的产量，确定合适添加量。

1.5.7 二甲基亚砜添加时间的确定

在最优二甲基亚砜添加量的基础上，分别在发酵16、18、20、22、24 h后添加二甲基亚砜，并检测72 h后的发酵产量。

1.5.8发酵液中L-赖氨酸含量的测定

将发酵液转移至100 mL容量瓶，并用蒸馏水定容至刻度。取发酵液1.0 mL，再用超纯水定容至100 mL，经0.22μm水系膜过滤后，上氨基酸分析仪进行测定。用0.01 mol/L的盐酸将赖氨酸标准溶液稀释到0.1 mmol/mL。进样量均为20μL，具体操作方法按照日立L-8900氨基酸分析仪自带分析方法，定量方法为单点校正法。

2 结果与讨论

2.1 马铃薯酶解液添加量（总糖）对L-赖氨酸发酵的影响

由图1可知，在赖氨酸发酵初始，随总糖浓度的增加，L-赖氨酸先增加后降低，120 g/L时达到最大。因此总糖以120 g/L为宜，此时赖氨酸产量可达54.02 g/L，再添加马铃薯酶解液以增加总糖量，赖氨酸产量逐渐降低，可能是过高的渗透压不利于发酵。

图1 总糖浓度对L-赖氨酸发酵的影响

2.2 玉米浆浓度对L-赖氨酸发酵的影响

图2显示在赖氨酸发酵的初始，随玉米浆添加量的增加，L-赖氨酸先迅速增加，当玉米浆浓度达到18 mL/L时达到最大，再增加玉米浆浓度，L-赖氨酸产量开始下降。所以玉米浆的浓度不宜过高，此时赖氨酸产量可达44.02 g/L。

图2 玉米浆添加量对L-赖氨酸发酵的影响

2.3 （NH4）2SO4浓度对L-赖氨酸发酵的影响

由图3看出，在赖氨酸发酵初始，随硫酸铵添加量的增加，赖氨酸产量迅速增加，硫酸铵浓度为25 g/L时，L-赖氨酸产量达到最大，达到49.99 g/L，再增加硫酸铵的量，L-赖氨酸产量降低。

图3 （NH4）2SO4添加量对L-赖氨酸发酵的影响

2.4 响应面法优化发酵培养条件

对单因素的试验结果，采用Box-Behnken响应面设计法进行优化。试验因素水平如表1所示，试验安排及结果如表2所示。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因素

表2 响应面试验设计及结果

表2显示了析因实验和中心试验的数据，利用Design Expert软件对表2数据进行多元二次回归拟合，可建立回归方程如下：

赖氨酸产量=54.51+6.8A+1.76B+11.77C-0.0013AB+0.005AC-3.42BC-11.71A2-2.21B2-13.15C2。

对该回归方程进行方差分析，见表3。由表3可知，该回归方程（p值＜0.0001）高度显著，失拟项（p值=0.9780）不显著，说明L-赖氨酸与总糖浓度（A）、玉米浆浓度（B）和(NH4)2SO4浓度（C）存在函数关系，其复相关系数的平方R2=0.9967，模型拟合程度很好，具有统计学意义，可用此方法来预测发酵培养的最优条件。

表3 回归方程的方差分析

2.5 响应因子水平的优化

利用Design expert绘制的响应曲面和等高线如图4～6所示。从响应面的最高值和等高线可以看出，存在赖氨酸产量的最大值，图中可以反映因素与因素之间交互效应［12］。从图5可以看出，无论是固定总糖的量，还是硫酸铵的量，改变另一个自变量，均能对L-赖氨酸产量有较大影响。可以看出随总糖和(NH4)2SO4浓度的升高，L-赖氨酸产量先增加后降低。而从图4可以看出，固定玉米浆的量，逐渐增加总糖的量，发现赖氨酸产量变化明显；而固定总糖的量，改变玉米浆的量，发现赖氨酸产量改变缓慢。在图6中，固定玉米浆的量，改变硫酸铵的量，发现赖氨酸产量改变明显；相反固定硫酸铵的量，改变玉米浆浓度，发现玉米浆浓度的升降对L-赖氨酸产量影响不明显。说明总糖和硫酸铵对L-赖氨酸发酵产量有明显影响，而玉米浆对L-赖氨酸的影响相对较小。

利用设计软件进行分析，可以得到最优培养基组成为：总糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米浆18.17mL/L。对响应面实验得到的最优培养基组成进行了3次平行验证实验，试验得到的赖氨酸产量的平均值是59.66 g/L，与预测值（58.136 g/L）相对误差小于5%，吻合度较高，说明此模型能够较好地预测实际发酵情况，且马铃薯水解液作为部分碳源用于发酵是可行的。

宁夏伊品生物科技股份有限公司以玉米淀粉水解液为碳源，利用本实验黄色短杆菌发酵赖氨酸产量可达到100 g/L以上；周勇等［13］在7 L发酵罐中，以葡萄糖为碳源发酵L-赖氨酸，产量可达161 g/L；白洁等［14］以酶处理甘蔗糖蜜为碳源，发酵生产赖氨酸达95 g/L。本实验中仅为59.66 g/L，说明碳源对于L-赖氨酸的影响非常大，说明如果改变传统碳源（主要是葡萄糖，或者淀粉水解葡萄糖）高产发酵赖氨酸，必须要重新考虑发酵工艺或者改善菌种。

图4 总糖和玉米浆浓度对L-赖氨酸产量影响

图5 总糖和（NH4）2SO4浓度对L-赖氨酸产量影响

图6 （NH4）2SO4浓度和玉米浆添加量对L-赖氨酸产量的影响

图7 生物素添加量对L-赖氨酸产量的影响

图8 二甲基亚砜添加量对L-赖氨酸产量的影响

2.6 生物素添加量对L-赖氨酸发酵的影响

由图7可知，在赖氨酸发酵的初始，随生物素添加量的增加，L-赖氨酸产量先迅速增加，120 μg/L后增加速度减缓，达到180μg/L后其产量可达63.01 g/L，再增加生物素的量，赖氨酸产量迅速下降。可能原因是当生物素亚适量时，细胞内脂肪酸合成不完全，导致磷脂合成不完全，从而增加细胞膜通透性，利于L-赖氨酸由膜内转移到膜外。当生物素添加过量时，细胞内会有大量磷脂积累，引起细胞膜或者细胞壁变厚，不利于赖氨酸分泌，局部的赖氨酸过高，又会抑制发酵，造成赖氨酸产酸率降低［15］。

2.7 不同二甲基亚砜添加量对L-赖氨酸发酵的影响

图8表明，随二甲基亚砜添加量的增加，添加量少于18mL/L时，L-赖氨酸呈增加趋势，添加量大于18mL/L，L-赖氨酸先迅速降低后缓慢降低。据报道，二甲基亚砜增加赖氨酸产量是增加了细胞膜的透性，也有报道说二甲基亚砜能够刺激微生物的代谢。但是过多的二甲基亚砜会导致细胞代谢下降，主要原因是二甲基亚砜本身就有一定毒性，会导致菌体死亡［16-17］。因此二甲基亚砜添加量以18mL/L为宜，此时赖氨酸产量可达64.99 g/L。

2.8 二甲基亚砜添加时间对L-赖氨酸产量的影响

由图9可以看出，在发酵16～18 h期间加入二甲基亚砜，L-赖氨酸产量增加；发酵18 h后加入二甲基亚砜，L-赖氨酸产量下降速率逐渐增大。所以发酵18 h时加入二甲基亚砜，L-赖氨酸产量最高。因此，二甲基亚砜最佳加入时间为发酵18 h时。

图9 不同时间加入二甲基亚砜对L-赖氨酸产量的影响

3 结论

本实验中，利用黄色短杆菌研究了马铃薯水解液作为发酵培养基发酵生产赖氨酸的培养条件。在未经优化的发酵条件下，发酵72 h，L-赖氨酸产量可达48.29 g/L。

利用响应面法考察了马铃薯酶解浓缩液、硫酸铵和玉米浆的最佳发酵培养基组成，以及生物素和二甲基亚砜对L-赖氨酸产量的影响。最终确定的最佳发酵培养基为：总糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米浆18.17mL/L，磷酸二氢钾4.0 g/L，生物素180μg/L，二甲基亚砜18 m L/L，MgSO4· 7H2O 2.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCO35.0 g/L，且在发酵18 h时添加二甲基亚砜较佳，此时L-赖氨酸产量达到64.99 g/L。

实验结果说明利用马铃薯渣作为碳源是可行的，但是以马铃薯渣酶解液为碳源发酵L-赖氨酸产量远远低于当今工业水平，提高产量还需要在菌种选育和发酵控制上作进一步研究。

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（责任编辑：朱小惠）

Optim ization of L-lysine fermentation w ith enzymatic hydrolysate of potato pomace as carbon source

FAN Ruijie1，2，ZHANG Anhong2，XU Qingyang1
(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750021，China)

In this study，fermentation of L-lysine by Brevibacterium flavum with condensed enzymatic hydrolysate of potato pomace as carbon source was investigated.The composition of total sugar(the amount of condensed enzymatic hydrolysate of potato pomace)，ammonium sulfate and corn steep liquor of the medium was optimized with response surface methodology.The optimal dosage of biotin and dimethyl sulfoxide(DMSO)was further analyzed based on the optimized medium.The final optimum fermentation condition was as follows：total sugar 125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，corn steep liquor 18.17 mL/L，biotin 180μg/L，DMSO 18mL/L.The DMSO was added after 18 h fermentation.The production of lysine reached 68.19 g/L and was 41.21%higher than that of non-optimal culture.The potato pomace was suitable carbon source for L-lysine fermentation.

potato pomace；L-lysine；fermentation

TQ922.3

A

1674-2214(2015)04-0034-06

2015-09-23

范瑞杰（1983—），男，宁夏银川人，硕士，研究方向为生物工程，E-mail：fanruijie1717@163.com.