肠球菌抑菌活性及其安全性的研究进展

郑 伟，李珍华，郦丹婷，张 忍，张 瑜，石陆娥

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036)

肠球菌属于乳酸菌，常见于人体肠道和日常发酵食品中.20 世纪初，国外就有学者开始研究肠球菌的抑菌活性，到目前为止，已有近10 000 篇相关文献可在Google Scholar、ScienceDirect 和SpringerLink 等数据库中检索到.同时，具有广谱抑菌作用的肠球菌已被应用于食品发酵和疾病治疗等领域，例如，在欧洲，尤其是南欧，含有肠球菌的发酵剂常常被用于传统奶酪的生产［1］;在我国，具有肠球菌的混合菌剂则被用于治疗动物腹泻和肠道炎症等疾病［2］.然而，有研究表明肠球菌在一定条件下，可以导致腹泻、菌血症、心内膜炎和尿道感染等疾病，其应用存在一定的安全隐患［3］. 为此，本文结合国内外参考文献，对肠球菌抑菌活性物质及其安全性进行综述，希望对肠球菌抑菌活性的研究及其安全使用起到一定的借鉴和指导作用.

1 抑菌活性物质

国内外学者对肠球菌的抑菌活性物质进行过大量的研究，发现肠球菌具有抑菌效应，主要是因为有机酸、过氧化氢、细菌素和类细菌素等物质的产生.

1.1 有机酸(Organic acid)

一般认为，有机酸可以通过延长致病菌的代时以及破坏正常细胞的膜电位，来使致病菌的生长受到影响，此外，未解离的有机酸还可以透过细胞膜进入致病菌的细胞质中，使胞内的pH 值降低，同时胞内游离的有机酸会进一步聚集，使得酸化程度加剧，最终导致细菌死亡［4］.Anyogu 等［5］从木薯发酵物中筛选出3株肠球菌，而这3 株菌的代谢产物均能够抑制致病微生物生长，尤其是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，随后相关试验发现，这3 株肠球菌的代谢产物之所以具有抑菌效应，是因为有机酸的产生和积累.

1.2 过氧化氢(Hydrogen peroxide)

在肠球菌的代谢过程中，氧分子会在黄素蛋白氧化酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH 氧化酶)的作用下形成过氧化氢［6］.形成的过氧化氢可以使细菌的一些关键酶发生氧化失活;也可以使细胞膜中的脂类发生过氧化反应，进而改变膜的通透性，导致膜内外紊乱;还有可以产生氧自由基，如超氧化物自由基()和氢氧化物自由基(OH·)，来破坏细菌的DNA，最终起到抑菌的作用［7］.

1.3 细菌素(Bacteriocin)

1.3.1 细菌素的定义与分类

随着研究不断地深入，人们对细菌素的认识也不断地完善，目前认为细菌素是指某些细菌代谢过程中，由核糖体合成并分泌到环境中的一类对同源或者亲缘关系较近的微生物具有抑制作用的蛋白质或多肽［8］.根据细菌素的特点不同，可将细菌素分为以下4 类:Ⅰ类，羊毛硫类抗生素;Ⅱ类，热稳定性小分子肽;Ⅲ类，热不稳定性大分子肽;Ⅳ类，蛋白质复合物.到目前为止，发现的大部分细菌素属于Ⅱ类，这类细菌素具有热稳定、耐酸碱、分子量小(大约是30 ～60 个氨基酸残基)和通常不经过修饰等特点［9］.

1.3.2 细菌素的合成与分泌调节

研究［10］表明，细菌素的合成与分泌都是从细菌的对数生长中期开始并一直延续到稳定期，并且该过程受到严格调控.通常情况下，细菌素的生产菌会分泌一种胞外信息素来对细菌素的形成进行调控，在细菌对数生长中期之前，这种信息素的含量很低，不足以启动细菌素的合成与分泌，但随着细菌数量的增加，胞外信息素的浓度也相应提高，直至达到某一阈值，细菌素才开始合成并分泌出来.

1.3.3 细菌素的抑菌谱与抑菌机理

通常认为细菌素的抑菌谱较窄，只作用于同源或者亲缘关系较近的微生物，然而有些细菌素除了作用于同源或亲缘关系较近的菌株外，还能对食物腐败微生物产生抑制作用［11］.例如细菌素S37，它不仅可以抑制亲缘关系较近的肠球菌，而且可以抑制李斯特氏菌(Listeria spp.)等腐败微生物的生长［12］.

关于细菌素的抑菌机理，一般认为，细菌素会非特异性或特异性地结合到细菌细胞膜表面上，而后引起一系列的抑菌作用，如:形成细胞质膜离子透性通道，影响膜内外质子电动势以及ATP 的合成;破坏蛋白质和核酸等大分子物质的合成，造成细菌新陈代谢的紊乱;引起细胞膜的穿孔，导致细菌因胞内物质的大量泄漏而死亡［13］.

1.3.4 细菌素的应用

目前，细菌素在食品中的应用方式主要有以下4 种:1)作为新型食品防腐剂应用于食品的防腐与保鲜;2)生产微生态制剂用于人体保健;3)直接添加细菌素到食品中或以细菌素产生菌作为发酵剂生产发酵食品;4)细菌素栅栏技术的应用.其中，研究最多和开发最成功的是食品防腐保鲜领域，现在正在开发和制备包含细菌素的食品包装袋和保鲜膜［14］.

细菌素在动物疾病治疗中也有一定的应用，例如在养殖业，人们已经开始逐步使用细菌素来替代原始抗生素去预防和治疗动物腹泻等肠道疾病［15］.尽管这类应用才刚刚起步，但迫于新型抑菌物质的开发缓慢以及抗生素耐药问题的日益严峻等情况，人们正在加快细菌素应用深化的脚步.

1.4 类细菌素(Bacteriocin like inhibitory substances，BLIS)

类细菌素比细菌素具有更为广阔的应用前景，这是因为大部分细菌素仅仅抑制与其亲缘关系较近的乳酸菌株和非乳酸菌的革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性菌和真菌则无效，而类细菌素不仅可以抑制亲缘关系较近的乳酸菌和革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有一定的抑制作用［16］.例如侯运华等［17］从一株肠球菌SE-81 中分离得到一种类细菌素物质LK-S1，抑菌试验结果表明，该物质对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌(Escherichia coli)及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等革兰氏阴性菌都有强烈的抑制作用.

2 安全性

尽管肠球菌具有抑菌作用并被应用到食品和疾病治疗等领域，但有研究表明肠球菌能够产生毒性，并引起人体的不适和致病，常见的有腹泻、菌血症、心内膜炎和尿道感染等［3］.因此，评估肠球菌的安全性显得十分重要，这将决定了其能否顺利地投入生产和使用.下面从耐药性和毒力因子两方面，简单地介绍一下肠球菌所存在的安全隐患.

2.1 耐药性(Antibiotic resistance)

耐药性之所以受到全世界人们的关注，是因为具有广谱耐药性的菌株将会导致治疗难度的增大、医治途径的减少和诊治效果的不佳.早在20 世纪40年代，人们就发现青霉素不能够很好地治疗肠球菌所引起的心内膜炎，此外，万古霉素，一种糖肽类大分子抗生素，原本可以有效地对付多重耐药性的肠球菌，但由于人们对万古霉素的滥用，导致抗万古霉素的肠球菌出现，从而增加了治疗肠球菌相关疾病的难度［18］.目前，除了发现抗青霉素和万古霉素的肠球菌外，还发现了抗氨苄青霉素、氯霉素、四环素、红霉素、环丙沙星、链霉素和庆大霉素的肠球菌，幸运地是，具有广谱耐药性的肠球菌还尚未发现［19］.关于肠球菌的耐药机理，人们也已经做过深入的研究，如表1 所示.

表1 肠球菌耐药机理Tab. 1 The antibiotic-resistant mechanisms of enterococci

另外需要注意的是，肠球菌能够通过耐药基因的转移，来获得新型抗生素的抵抗能力，所以，未来的研究方向不能只限于新型抗生素的发现.Arias 等［18］认为可以从肠球菌附着和定植胃肠道的机制出发，找到新的方法来抑制或减少肠球菌在胃肠道中的定植，也可以与免疫技术相结合，研发出一种综合性的治疗方法.

2.2 毒力因子(Virulence factor)

肠球菌之所以具有安全隐患，还有一个重要原因，即含有毒力因子(表2).这些毒力因子不仅可以帮助肠球菌附着并破坏宿主细胞，而且可以对宿主体内的特异性免疫和非特异性免疫产生抵抗作用.

表2 肠球菌的毒力因子Tab. 2 Enterococcal virulence factors

2.2.1 聚合物和肠球菌表面蛋白(Aggregation substance and enteococcal surface protein)

聚合物，是由性信息素质粒所编码形成的，具有粘附作用的细菌表面蛋白，它呈毛发状，并不均匀分布在细菌表面，在它的一级结构中，存在两个RGD 序列，该序列可以与真核细胞表面受体整合素相结合，从而介导细菌与真核细胞之间的粘附，同时，也可以通过纤连蛋白结合到胞外基质中［24］.Chow 等［25］通过动物实验发现，与未感染心内膜炎的小兔相比，被感染的小兔体内聚合物含量明显上升，但只有同时提高聚合物和细胞溶素(另一种毒力因子)的表达量，小兔的死亡率才会上升.这表明在感染致病的过程中，聚合物起到的主要是粘附作用，而致病作用是由细胞溶素引起的，并且缺少其中的任何一个都不能引起小兔的死亡.

肠球菌表面蛋白，是由esp 基因编码形成的高分子量表面蛋白，共含有1 873 个氨基酸残基，按照结构和功能的不同，可划分为4 个区域，分别为N 端结构域、核心区、C 端跨膜区和锚定域［26］.Heikens 等［27］认为在感染致病过程中肠球菌表面蛋白量之所以会增加，是因为该表面蛋白会参与粘连宿主细胞和生物膜形成的过程，而粘连的发生和生物膜的形成是肠球菌感染宿主细胞的关键步骤，所以随着感染的发生，肠球菌表面蛋白的表达量也就随之增加.但是，也有学者对这点提出了质疑，Elhadidy 等［28］发现esp 基因与生物膜形成之间没有必然的联系，在38 株能够形成生物膜的肠球菌中，有52.63 %(20/38)的肠球菌是不含有esp 基因的，另外，有2 株肠球菌虽具有esp 基因，但自身却无法合成生物膜.目前尽管学者们对肠球菌表面蛋白的功能机理仍存在争议，但可以肯定的是，肠球菌表面蛋白是一种毒力因子，会参与肠球菌感染致病的过程，同时机体也会产生相应的免疫抗体，来减少肠球菌表面蛋白的形成［26-27］.

2.2.2 细胞溶素和明胶酶(Cytolysin and Gelatinase)

细胞溶素，又称β-溶血素(β-hemolysin)，是肠球菌具有毒性的一个重要因素.一般认为，细胞溶素是由革兰氏阳性细菌产生的二肽溶解毒素，与lantibiotics 和链球菌溶血素S 属于同一家族，其不论是对原核细胞，还是真核细胞都能够产生溶解现象［29］.

早在1984年，Ike 等［30］就提出细胞溶素是一种毒素的观点，并证实了细胞溶素能够对小鼠产生杀伤性.现在关于肠球菌毒性和细胞溶素之间的关系，已在不同的动物模型中得到了证实，如表3 所示.与此同时，人们还发现能够合成细胞溶素的肠球菌往往也能够合成聚合物.针对这一现象，Franz 等［19］提出了一个可能性的解释，即编码细胞溶素和聚合物的基因位于同一个质粒上.

表3 肠球菌细胞溶素在不同动物模型中的作用Tab. 3 The effect of the enterococcal cytolysin in different animal models

明胶酶，是由基因gelE 编码合成的一种分泌蛋白酶，其操纵子frs 是编码合成的关键因素，即使是在基因gelE 存在的情况下，若frs 缺失或者不完整，明胶酶的合成也会受到阻碍［34］.

关于明胶酶的毒性，目前一个比较公认的观点是，明胶酶会参与生物膜的形成，同时，自身也可以降解宿主体内的一些重要物质，如组织中的明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、内皮缩血管肽、血管舒缓肽、抗菌肽和补体等.胶原蛋白和纤维蛋白的降解，会使得肠球菌离开最初的附着位点转移或扩散到其他敏感性的位点;抗菌肽和补体的分解，可以使机体的免疫系统失效或者破坏［35］.另外需要注意的是，在肠球菌属的范畴内，基因gelE 的分布相当广泛.有数据［36］表明，在29 株肉源性肠球菌中，有58.63 %(17/29)的肠球菌具有gelE 基因，而其他毒力因子的基因分布率都低于50%.

2.2.3 过氧化氢调节因子(Hydrogen peroxide regulator)

一些研究表明过氧化氢调节因子与肠球菌的毒性是有关联的.它属于LysR 转录因子家族，是肠球菌氧化应激反应中的一个特有的转录调节因子.在此反应中，肠球菌会产生并分泌抗活性氧的蛋白酶，使得活性氧失活，从而减少机体中巨噬细胞或中性粒细胞的免疫作用，因此，可以认为过氧化氢调节因子是有利于肠球菌抵抗机体的免疫系统，并提高其在机体内的存活率和致病率［37］. 据Vernenil 等［38］研究表明，HypR 缺失性突变体，对过氧化氢高度敏感，也易被巨噬细胞吞噬消灭，同时，对小鼠的毒性也大大降低，与野生型相比，在感染120 h，小鼠的死亡率由100 %降低到了50 %.

2.2.4 荚膜多糖(Capsular polysaccharides)

许多致病微生物都能够产生荚膜多糖，而荚膜多糖的存在可以帮助致病微生物躲避机体免疫系统的识别和清除，从而有利于微生物在宿主体内的存活.粪肠球菌能够产生4 种荚膜血清型A，B，C，D，而只有产血清型C 和D 的粪肠球菌，才能够真正合成荚膜多糖［39］.Thurlow 等［40］表明由9 个基因(cpsC-cpsK)构成的荚膜基因座是荚膜多糖形成的关键，而血清型C 和D 含有上述荚膜基因座的所有基因，并且cpsF 基因决定了血清型C 和D 的特异性.Thurlow 等［41］还认为肠球菌的荚膜多糖存在多个功能机制，如对机体调理性吞噬的抵抗以及肠球菌表面抗原的隐藏等.在抗体缺乏的情况下，调理素C3 会分裂成为C3b，这样有利于调理素免疫功能的发挥，与缺乏荚膜的肠球菌相比，带荚膜的肠球菌能够通过抑制C3 和C3b 的积累和识别，从而有效地抑制机体的调理性吞噬;另外，机体体内一般存在着一套免疫监控体系，主要是通过病原菌识别受体(Pathogen recognition receptors，PRRS)来检测和识别致病相关联分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，从而达到监控目的，与肠球菌相关联的PAMPs 是脂磷壁酸，而荚膜多糖的存在可以有效地隐藏肠球菌表面的脂磷壁酸，从而减少PRRS 对脂磷壁酸的识别，提高肠球菌在机体内的存活率.

3 结论与展望

肠球菌能够产生多种抑菌活性物质，如乳酸、过氧化氢、细菌素和类细菌素等，而且不同的肠球菌可以产生不同类型的细菌素和类细菌素，因此，发现新颖并具有广谱抑菌活性的细菌素或类细菌素是未来研究的主要方向之一.

另外，目前有两种常规的方法可以将肠球菌应用到日常饮食当中:一种是直接将肠球菌加入到待加工的食品中，然后一起培养发酵;另一种是将纯化或者半纯化的抑菌物质制成药物或试剂.由于肠球菌有可能产生毒力因子，同时有可能对多种抗生素产生耐受性，所以，在直接使用肠球菌之前，需要对其进行安全性评价，而将肠球菌抑菌活性物质进行分离和纯化，则无需考虑肠球菌的安全性问题，因此，分离纯化肠球菌抑菌活性物质将是另外一个重要的研究方向.

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