兰属植物遗传资源核心种质构建探讨

何仁锋，陈 喆，姜梦莹，周淑婷，应奇才，冯尚国，王慧中

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江省药用植物种质改良和质量监控重点实验室，浙江 杭州310036)

随着国际合作与交流的扩大及植物种质资源的不断收集，收藏的种质数量迅猛增长，大量的种质资源为种质选育提供丰富遗传基础的同时，在一定程度上导致了植物种质的保存、评价、研究和利用困难.1984年，Frankel 等［1-2］提出了一条高效管理、利用种质资源的有效途径——构建植物核心种质.研究证明［3-4］，核心种质的构建是一种能够快捷有效地从遗传资源中提取所需特性资源材料的有效途径，大大提高育种成效.因此，该研究正逐步成为国际遗传资源研究的热点，引起了世界各国的广泛重视.

兰属是兰科(Orchidaceae)兰族萼足兰涯族(Subtrib.Cyrtopodiinae Benth)的一个属，俗称兰花，在《金漳兰谱》、《兰易》、《兰史》等古籍中均有记载，我国有硬叶兰、虎头兰、墨兰等29 种兰属植物和一些变种［5］(表1)，具有重要的经济、观赏价值和广泛的利用前景.而庞大的兰属种质资源收集导致其保存成本增加，严重影响利用效果，也增加特异种质材料筛选、挖掘的难度.此外，受到人为因素肆意采掘，许多名贵兰属物种生境遭到严重破坏，分布范围急剧缩小，资源日益减少，处于濒危灭绝的境地，加之盲目引种、过度选择及对兰属种质资源的开发利用缺乏技术支撑等原因，兰属植物种质资源保护与研究现状令人担忧［6-7］.核心种质作为种质资源群体研究和利用的切入点，能有效提高整个种质资源的管理和利用水平.目前，国内外许多观赏花卉如菊花［8］、牡丹［9］、梅花［10］及郁金香［11］等均开展了遗传资源核心种质构建研究，而兰属植物遗传资源核心种质构建的研究尚未见报道.因此，开展兰属植物核心种质构建研究是对名贵植物种质资源保存研究的必然趋势，将为兰属植物种质资源的有效管理及开发利用提供新的思路和方法.

本文借鉴农作物成功的经验，围绕核心种质的基本概念阐述兰属核心种质的特性、研究内容与步骤、应用与管理及遗传多样性和实用性评价等方面内容，以期为兰属植物核心种质的构建和种质创新与利用提供理论参考，促进兰属植物种质资源研究理论和实践共同发展.

1 核心种质概念和兰属植物核心种质的特性

据不完全统计，截止2011年，全世界非原生境保存的植物收集品已达740 万份，我国长期库保存39.2万份，这给特异材料挖掘和利用等均带来困难［12］.核心种质(Core collection)是指用最少的资源数量和最小的遗传冗余最大限度地代表该物种最丰富的遗传多样性、结构及整个群体的地理分布［1-2］.同时，其作为优异基因发掘、新技术应用和遗传资源深入研究的优先样品集，提高了种质资源的利用效率［13］.植物核心种质一般具备以下特征［14-15］:1)在遗传组成和生态类型等方面具有良好的多样性和代表性;2)最大限度地避免遗传冗余，同时保证核心种质的异质性;3)具有实用性，有利于重要基因资源挖掘与利用.随着育种目标及实际需求的多元化，核心种质的内涵也正在进一步深化.

根据兰属植物的特点，认为其核心种质应具备以下特征［16-19］:1)兰属核心种质应具有动态的层次结构，保证初级核心种质、核心种质和核心应用种质等各层次结构在内容与信息上相互补充和动态变换;2)兰属植物地理分布不均匀，部分物种孤点分布，核心种质具有区域遗传结构差异的特性;3)杂交和变异现象普遍存在于兰属植物，应包含当前主要变异类型:长/短苞、花序分枝等;4)包含生产实践所需要的优异农艺性状或基因，同时囊括各地野生兰属物种道地性:如独具特色的粤北银边、金边春兰等.

2 兰属植物核心种质的研究内容

2.1 兰属植物种质资源数据的收集整理

建立核心种质的数据主要包括3 种类型:基本数据、性状评价鉴定数据和特征数据.基本数据是核心种质构建中应用最广泛的一类数据，主要包括种质选育地、选育地的生态地理状况、育种体系、分类体系等;性状评价鉴定数据包括质量、产量及抗性等农艺性状;特征数据是形态、生化、分子标记等表特征的一类数据.在兰属研究中，以上数据的获取主要从中国植物标本馆的标本记录，国家重要植物博物馆的数字化标本信息分享平台，中国兰科植物数据库等.其次，参考全国各地方已公开出版的地方植物志及描述地方特色的兰属植物文献资料，全国和省级各类兰属植物及兰科专题论文及描述中国兰属植物内在特征与遗传分析的科学文献［19-20］.

2.1.1 兰属基本数据 全属约48 种，主要分布于亚热带和亚洲热带以及澳洲北部，在我国以西南分布最多，其次是东南地区，台湾也有分布［21］.如春兰、蕙兰较耐寒，分布较靠北;硬叶兰、纹瓣兰、多花兰等则多在海南，我国各兰属植物种质分类及分布详见表1.兰属植物主要通过引种驯化、杂交、诱变、基因工程等方法育种，其中杂交育种是当今兰花新品种选育的主要手段，其杂交属和集体杂种在《Sander′sList of New Orchid Hybrids》(http://www.Rhs.Org.uk/plants/registerpages/orchid_parentage.Asp.)均有描述.

2.1.2 兰属特征数据 主要包括叶、花、萼片、唇瓣等多个形态学指标的描述［22］及部分生理生化指标［23］.随着RAPD、SSR、SRAP 等DNA 分子标记技术研究的深入，为兰属提供了丰富的特征数据信息.如利用SRAP 和SSR 分子标记技术对兰属植物进行遗传多样性研究［24-25］;李小白［26］等完成建兰花转录组高通量测序研究.兰属植物遗传多样性等方面的研究均为构建高质量核心种质提供了重要特征数据.其中有学者认为SSR 标记技术具有多态性丰富，稳定性好，以孟德尔方式遗传，呈共显性遗传，染色体特异性及操作简便等优点.如卜海东［27］等采用SSR 分子标记手段，对201 份砂梨、白梨、秋子梨和西洋梨资源进行分子标记核心种质构建研究，最终确定36 份核心种质. 由此可见，在兰属植物核心种质构建过程中利用SSR 分子标记技术将可能成为一种最佳的选择［14］.同时，有助于在短时间内获得群体的结构和部分分类信息，推动和优化构建核心种质库的抽样策略.

2.1.3 兰属性状评价鉴定数据 形态农艺性状作为检测其它类型数据真实性的重要参照之一，能直观地反映材料的环境适应性和育种潜力，如李保印［9］构建中原牡丹的初级核心种质采用了牡丹大量形态农艺表型性状.目前，兰属种质性状评价鉴定数据主要包括株幅、萼片长/宽、花径、花序长、叶片数、叶长/宽和苞片长等植物数量性状和香味、花朵外观、花主色、和斑色纹等质量性状，但数据不够全面，有关抗逆性材料数据缺乏，科学性有待提高［28-29］.为了更有效对核心种质构建发挥作用，在观赏植物核心种质构建中研究者多采用观赏形态、农艺性状表型数据和分子标记信息数据相结合的方法［30］.借鉴国内外构建核心种质的成功经验，我们建议在构建兰属植物遗传资源核心种质中尝试整合形态、农艺等性状数据结合SSR等分子标记数据，即开展兰属EST-SSR 引物开发，有效利用EST-SSR 等分子标记信息和形态、农艺性状数据，系统评价兰属个体间的遗传差异，提高核心种质遗传代表性.

表1 我国主要的兰属植物及变种一览表Tab. 1 A list of the main species and varieties of Cymbidium plants in China

续表

2.2 兰属植物种质资源的取样策略

2.2.1 兰属种质资源收集数据分组

数据分组是植物核心种质构建的首要环节之一，种质资源分组是根据现有的数据，把具有相似特点的种质材料划分为一组，常见的分组标准有分类体系、地理起源、农业生态分布、育种体系、遗传标记、农艺性状及多数据结合等.兰属种质资源分布不均匀，可根据其特点及研究现状进行分组，依据兰属植物生长环境的母岩和土壤pH 值划分:春兰、寒兰等是典型的喜酸种类，而多花兰、蕙兰等对土壤要求不严格［31］;根据形态特征将品种分为兜瓣型、竹叶瓣型、奇瓣型和多花型等［32］;根据种的行政区域分布划为云南、贵州、广西等17 个分布型［20］. 因此，在兰属植物研究中，首先统计兰属种质资源的特征和所收集的数据差异，其次，利用兰属种质的相似特点:种质地理来源、农艺及观赏性状、生境、抗性等多数据组合进行多层次逐步分组，通过材料间的遗传距离进行逐级聚类［33］，使各类分组相互补充和验证，最后进行比较优化，确定最佳的分组方案.

2.2.2 兰属植物种质资源组内取样及规模确定

确定合理的取样方法及取样比例是植物核心种质构建的关键步骤，取样方法主要有完全随机和系统取样.系统取样法不仅考虑了材料的遗传结构，给不同材料以不同权重，还可以有效防止生物遗传类型漏掉，保证核心种质的遗传代表性，因此实际研究中多采用该方式.组内取样比例应根据各组的遗传特点采取合适的取样策略来确定，李自超［34］等在云南地方稻种资源核心种质取样方案研究中表明，以平方根或对数法确定组内取样比例，采用聚类法在组内进行取样是最佳取样方案.由于物种遗传结构、遗传多样性状况和样品收集程度等情况的差异，至今前人的研究尚未提供一个合理的取样比例和合适的核心种质规模［35］.因此，在研究兰属核心种质构建中，建议在考虑现有兰属种质资源的生物多样性遗传结构层次及外因影响基础上，按地理分布、分类体系、育种体系或多体系组合分组，分层次，依次聚类系统取样，确立适当的取样规模，比较得出最佳的取样策略［30］.对于建兰、墨兰、大花蕙兰等某些曾经大面积推广过的品种(品系)、骨干亲本以及有较大研究利用价值的兰属种质可以适当优先入选核心样品，同时应适当增加样本入选量.兰属种质群体相对较小，所构建的核心种质份数也应相对较少，而具体的取样比例的大小还需要进一步研究和探讨，此外，为满足不同层次和不同研究方向的研究者对其核心种质的需求，有待整合构建不同规模、不同研究方向的兰属植物微型核心种质库:如切合兰属植物育种与市场需求的微型核心种质库，发掘包括控制花期、花色及抗冻性强等方面新的有利基因［36-38］.

2.3 兰属植物核心种质的管理与利用

兰属植物遗传资源核心种质构建后，要建立和完善繁种、供种及管理体制并及时补充和完善核心种质有关数据，使其结构和样本数目进一步更新、补充或筛减［39］，以保证核心种质高效的利用率.育种工作者则可以根据兰属植物改良株型、增加花香和提高抗逆性的育种与遗传研究目标，从核心种质库中有目的、有方向、有重点地提取材料，加快新品种的研究. 此外，叶姿叶型、花型和花色等也是重要的育种目标. 因此，有必要加强含控制某些特殊性状基因的遗传材料的选育［37］及特定抗性基因挖掘与克隆［38］等方面的研究，以此强化核心种质的完整性和实用性.

2.4 兰属植物核心种质遗传多样性和实用性的检测与评价

从核心种质的概念出发，其要求以最少的资源数量和最小的遗传冗余来最大限度地代表物种遗传资源的多样性，并满足当前与未来的生产实践需求.因此，需对核心种质进行遗传多样性和实用性检测与评价.检验评价的方式主要有核心种质遗传多样性的符合性检验和核心种质实用性检验［13］.

由于兰属材料原始数据形式的不同，其核心种质多样性的符合性检验评价数据指标可分为离散性数据和连续性数据.兰属遗传资源连续性数据主要包括株幅、根长等各种数量性状的方差、变异系数、变异幅度、平均值及标准差等，具体可参考段艳皊［28］等的方法进行遗传多样性评价.评价标准参考Hu［33］等人的研究，即少于20%的性状均值及变异幅度与原种质资源的均值与变异幅度存在显著性差异，且核心种质各性状的变异幅度不低于原群体80%，则认为该核心种质代表了原种质资源的遗传变异及结构.前人多将均值、标准差、变异系数等连续性数据参数作为植物核心种质的检验指标［40］.近年来，质量性状和SSR分子标记数据等离散性数据也被广泛应用于核心种质遗传多样性的检测，主要指标有多态性位点数、多态性百分率、Nei′s 基因多样性指数，具体可参考黄焱等［41］的方法.总之，兰属核心种质的评价标准应该是可变的，应根据新状况而尝试采用灵活多变的遗传多样性评价方法.

实用性的检测主要是对兰属核心种质中是否保留已知农艺性状及其他性状(基因)进行检验，评价其能否在实际应用中为特定性状基因材料的挖掘和育种研究提供服务.对此，进行兰属植物遗传资源核心种质实用性评价时有必要邀请具有一定兰属植物育种经验的专家参与评价.

3 核心种质在兰属植物种质中的应用

开展植物种质资源遗传多样性分布特点及规律研究，对充分发掘现有种质，理选配亲本和拓宽育成品种遗传基础等具有重要意义.首先，优先利用核心种质可以为研究者探究种质资源的遗传特性提供捷径，如栾维江等［42］利用SSR 标记分析东北春大豆中的核心种质的遗传多样性，总结出了东北春大豆种质资源的遗传多样性分布特点，为有目的选择杂交亲本培育新品种提供了依据.鉴于东北春大豆的成功经验，可构建兰属植物遗传资源核心种质来了解和评价兰属植物种质资源群体遗传特性.

其次，核心种质的建立为加强和实现种质资源的有效管理和开发利用提供了便利，在作物的生产和育种方面也发挥了巨大作用，特别在发掘特殊优异基因资源方面.近年来，国内、外利用核心种质对小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)［43］、西瓜枯萎病抗性［44］及优质稻种的抗稻瘟病、白叶枯病［45］等优良性状进行鉴定，已有成功的报道.由上述作物的成功经验可知，核心种质的应用对于种间亲缘关系的鉴定、特定抗性基因材料的挖掘和具有特殊性状的遗传材料的选育等方面具有效果，因此，随着兰属植物核心种质库的不断完善，兰属植物核心种质也将在兰属植物遗传和育种实践中发挥作用，融合特异的高产源、优质源和抗源.遗传资源研究者可以通过全面、详细的考查、分析和鉴定核心种质，快速从核心种质中筛选得到所需要的资源或基因，减少在育种过程中选配亲本的盲目性，减少和降低劳动投入与成本，摆脱兰属植物优良亲本缺乏和选育品种遗传背景狭窄的局面［13］.

4 问题与展望

兰属种质资源数量大、遗传背景模糊、考种程序繁杂以及生境地域的复杂性，这些问题都增加了兰属植物种质资源研究的难度.目前，兰属植物种质资源遗传多样性的研究还不够全面和深入，兰属植物遗传资源核心种质的研究尚处于探讨研究阶段，理论及方法还不完善，其中取样策略和检验体系是建立高质量兰属核心种质中关键问题和技术难点，有必要对其进一步探究.

可以从以下几方面展开:首先，将兰属植物种质资源普查作为一项长期工作，充实和完善基本数据;其次，加强对重点材料的重点保护与探索，特别是优异种质和基因资源的收集.加强国际合作，积极引进新育成的特种兰属种质资源，弥补国内某些紧缺和空白，适当繁殖以供利用.同时借鉴成功构建核心种质物种的研究经验，有重点地进行花色、花香等重要性状［36-37］挖掘与相关基因定位与克隆工作，根据育种方向深入研究其亲缘关系与遗传多样性，尤其提高SSR、SNP 等分子标记的开发.然后，积极开展地方特种兰属植物的特殊基因转育研究.最后，加强兰属种质资源的检测与评价工作，开发创新性评价数据，尤其要加强兰属的优质源、抗源以及分子水平鉴定评价工作，实现核心种质动态性管理，健全资源开发、利用和共享机制.

种质遗传资源的收集和保存是培育新品种的基础，因此，兰属植物遗传资源核心种质的保存也是当前研究的重点.目前，植物保存主要集中在田间基因圃、原位实地保存、DNA 保存、花粉贮藏、离体保存基因、超低温保存等［46］.兰属植物应根据自身的特点，在深入研究其遗传物质与特性基础上，灵活采用超低温保存中的干燥法、快冻法和玻璃化法等保存兰属种质资源［47］，并建立相应的资源圃.同时参考国兰鉴赏标准［48］及《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南·兰属》［49］的规定，规范记录描述种质数据，实现最大限度的保存兰属种质资源遗传完整性，为核心种质的筛选提供重要的参考价值.

目前，针对兰属植物遗传资源核心种质构建的研究虽然尚未见报道，但其应用前景喜人.同时，随着国家对兰属植物种质资源的保护和保存工作的重视以及兰属植物种质资源研究的深入，核心种质将解决我国兰属植物育种种质基础狭窄的一个有效途径.有关的研究工作必将发现新的特有基因和起源、演化、分类方面的新规律，为兰属植物种质资源保护、优异基因创新和优良品种选育等提供科学依据，同时提高其育种效率和种质资源利用率，提升共享服务水平.

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