姜黄素促进紫杉醇抑制肿瘤细胞的增殖

虞 游，卢佳伟，姚卉卉，陈建明

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

据全国肿瘤登记中心发布的《2013中国肿瘤登记年报》显示，我国肿瘤发病率和死亡率整体呈现上升的趋势.恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年上升已经对人们的健康生活造成了极大的威胁.目前，癌症的治疗手段主要以手术、放疗和化疗为主，但通常预后效果较差且毒副作用较大.诸如紫杉醇（Paclitaxel，PTX）等常规的化疗药物，不仅对患者具有较大的毒副作用，而且价格昂贵.

最新研究发现，一些植物类提取物能够抑制肿瘤细胞增殖，同时不会损伤健康的细胞.进一步研究发现，这类植物类提取物还能够增强一些肿瘤化疗药物的疗效.姜黄素（Curcumin，CUR）来源于姜科植物，在我国常被作为食品添加剂用于食品加工过程中.但国内外最新的研究发现，姜黄素具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等多种药理性质［1-3］.相关研究结果表明，姜黄素能够有效地抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡［4］.本研究以人喉鳞癌细胞Hep-2和人肝细胞癌细胞Hep G-2为材料，利用姜黄素和紫杉醇联合处理两种肿瘤细胞，探讨姜黄素能否促进紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖，为姜黄素用于肿瘤辅助治疗提供一定的理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料及仪器

人喉鳞癌细胞Hep-2（购自上海中科院细胞库）、人肝细胞癌细胞Hep G-2（杭州师范大学基础医学部刘晓玲老师馈赠），DMEM、RPMI-1640 培养液（武汉博士德），新生小牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（EDTA，含酚红）、青霉素／链霉素（Gibco），DMSO、结晶紫染料（上海生工），WST-1细胞毒性及增殖检测试剂盒、Hoechst 33258细胞凋亡检测试剂盒（碧云天），姜黄素（Bio Basic），紫杉醇（上海生工）.

CO2培养箱（Heal Force HF151），单人双面垂直净化工作台（上海博讯VS-840-2），酶标仪（Bio-RAD 680），相差倒置显微镜（Nikon TS100）、全自动正置荧光DIC显微镜及成像系统（Nikon 90i）.

1.2 细胞培养

人喉鳞癌细胞Hep-2和人肝细胞癌细胞Hep G-2分别贴壁培养于含10%小牛血清及1%青链霉素的RPMI-1640和DMEM 培养液中，于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每隔2～3 d进行换液.当细胞汇合度达到90%以上，用0.25%胰蛋白酶按照1∶3的比例进行消化传代.选取对数生长期且状态良好的细胞用于实验研究.

1.3 细胞增殖检测

取对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔接种3 000个细胞于100μL 培养液中，常规培养24 h.按实验要求，利用不同浓度的姜黄素（0～50μmol／L）和紫杉醇（0～5 nmol／L）进行单独或联合处理（5 μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX、10μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX）48 h.处理结束后，按说明书每孔加入10μL的WST-1检测试剂，充分混匀于37℃孵育1 h后，通过酶标仪检测450 nm 处的吸光度.相对细胞增殖率的计算如下：将对照组设为1，计算处理组与对照组的比值作为相对细胞增殖率.每次实验3个复孔，独立实验重复3次.

取对数生长期的细胞接种于12孔板中，每孔接种10×104个细胞于1 m L 培养液中，常规培养24 h后按实验要求分别用1%DMSO、10μmol／L CUR、0.5 nmol／L PTX 和10μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX处理48 h.处理结束后吸尽培养液，用PBS洗2遍，每孔加入1 m L 乙醇4 ℃固定15 min，吸尽乙醇后，再用PBS洗1遍，每孔加入1 m L 0.2%结晶紫染液室温染色10 min，用PBS将多余的染料洗净后，观察细胞密度并用数码相机拍照.每次实验3个复孔，独立实验重复3次.

1.4 细胞凋亡检测

取洁净的盖玻片于70%的乙醇中浸泡10 min，随即用PBS洗2遍后再用培养液洗1遍后置于6孔板中.取对数生长期的细胞接种至6孔板，每孔接种2×105个细胞于2 m L培养液中，常规培养24 h后，分别利用1%DMSO、10μmol／L CUR、0.5 nmol／L PTX 和10μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX 处理48 h，处理结束后吸尽培养液，每孔加入1 m L固定液（4% 多聚甲醛）4℃固定15 min，吸尽固定液，用PBS洗2遍，随即每孔加入0.5 m L的Hoechst 33258染液，避光染色5 min后，再用PBS洗2遍.最后，在载玻片上滴一滴封片液，小心地取出细胞爬片倒置于载玻片上，装片后于荧光显微镜下观察细胞核颜色并拍照.

1.5 统计分析

实验数据经描述性统计分析，样本之间采用t检验，结果以表示，P＜0.05表明差异有统计学意义.

2 结果

2.1 姜黄素、紫杉醇对肿瘤细胞增殖的作用

WST-1结果表明，不同浓度的姜黄素（5、10、20、40、50μmol／L）处理48 h后，对Hep-2和Hep G-2细胞的增殖均具有抑制作用，并且呈现出一定的剂量效应关系（图1A）；同样，不同浓度的紫杉醇（0.5、1、2.5、5 nmol／L）处理48 h后，对Hep-2和Hep G-2细胞的增殖也具有抑制作用，并表现出剂量效应关系（图1B）.

2.2 姜黄素促进紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖

WST-1结果显示，5μmol／L和10μmol／L的姜黄素联合0.5 nmol／L的紫杉醇处理Hep-2和Hep G-2细胞48 h，联合处理组细胞相对增殖率与紫杉醇单独处理组相比明显降低，且随着姜黄素浓度的增加，联合处理的效果更为明显（P＜0.01，图2A 及表1）.同样，结晶紫染色结果表明，10μmol／L的姜黄素联合0.5 nmol／L的紫杉醇处理两种细胞48 h，联合处理组细胞密度明显低于紫杉醇单独处理组（图2B）.上述结果表明，姜黄素能够促进紫杉醇抑制肿瘤细胞的增殖.

图1 姜黄素、紫杉醇对Hep-2和HepG-2细胞增殖的影响Fig.1 Effects of curcumin or paclitaxel on the proliferation of Hep-2 and Hep G-2 cells

图2 姜黄素联合紫杉醇对Hep-2和HepG-2细胞增殖的影响Fig.2 Effects of curcumin combined with paclitaxel on the proliferation of Hep-2 and HepG-2 cells

表1 姜黄素联合紫杉醇对Hep-2和HepG-2细胞增殖的影响Tab.1 Effects of curcumin combined with paclitaxel on the relative proliferation of cells（n＝3，±s）

表1 姜黄素联合紫杉醇对Hep-2和HepG-2细胞增殖的影响Tab.1 Effects of curcumin combined with paclitaxel on the relative proliferation of cells（n＝3，±s）

＊＊，P＜0.01；＊＊＊，P＜0.001 vs the PTX-treated group（0.5 nmol／L）

处理组 Hep-2／% Hep G-2／%DMSO 100.00±4.48 100.00±0.93 5μmol／L CUR 91.52±2.79 94.06±2.21 10μmol／L CUR 76.36±4.68 80.13±3.66 0.5 nmol／L PTX 90.38±2.34 87.96±1.45 5μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX 74.44±3.89＊＊ 57.93±4.56＊＊＊10μmol／L CUR＋0.5 nmol／L PTX 40.92±1.32＊＊＊ 46.93±2.63＊＊＊

2.3 姜黄素促进紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡

Hoechst 33258染色结果表明，姜黄素（10μmol／L）单独处理细胞48 h后，极少数细胞染色质固缩，细胞核致密浓缩；紫杉醇（0.5 nmol／L）单独处理细胞48 h后，少数细胞发生凋亡；姜黄素（10μmol／L）和紫杉醇（0.5 nmol／L）联合处理细胞48 h后，细胞核逐渐由正常的蓝色变为亮蓝色甚至是白色，凋亡细胞的比例明显增多（图3）.上述结果说明，姜黄素能够促进紫杉醇诱导细胞凋亡.

图3 姜黄素联合紫杉醇对Hep-2和HepG-2细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of curcumin combined with paclitaxel on the apoptosis of Hep-2 and Hep G-2 cells

3 讨论

近年来，肿瘤的发病率和死亡率的逐年上升已经给人们的健康生活带来了严重的威胁.传统的治疗不仅具有较大的毒副作用，而且预后效果也不理想.因此，寻求毒副作用较小、效果更好的联合治疗方法，对于临床上用于肿瘤病人的治疗显得尤为重要.

紫杉醇是临床上常用的一种化疗药物，但其在化疗过程中经常会出现药物抗性、毒副作用大等问题，因而在临床使用上会受到极大的限制［5］.近年来，相关研究发现，一些植物类提取药物具有抑制肿瘤细胞增殖、增强常规化疗药物药效的作用.姜黄素是一种来源于姜科植物的化学物质，众多的研究结果显示，姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抗氧化等药理性质，进一步的研究发现，姜黄素能够增强抗肿瘤药物抑制细胞增殖［6-8］，同时还能够增强肿瘤放化疗的敏感性［9］.

本研究以人喉鳞癌细胞Hep-2和人肝细胞癌细胞Hep G-2为研究材料，用姜黄素（10μmol／L）和紫杉醇（0.5 nmol／L）分别或联合处理细胞48 h后，WST-1检测发现，联合处理组的细胞相对增殖率明显低于紫杉醇单独处理组，说明姜黄素能够促进紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖；结晶紫染色的结果进一步说明，姜黄素对紫杉醇抑制细胞增殖具有促进作用；最后，我们利用Hoechst 33258凋亡染色试剂盒，通过观察细胞核的颜色判断细胞凋亡.结果表明：联合处理组的细胞其细胞核颜色由正常的蓝色变为亮蓝色，表明细胞发生凋亡；且联合处理组的细胞凋亡率明显高于紫杉醇单独处理组的细胞凋亡率.本研究结果表明，姜黄素能够抑制肿瘤细胞增殖，并且能够促进紫杉醇抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.Zhan等［10］利用姜黄素和紫杉醇联合处理人乳腺癌细胞MCF-7发现，姜黄素能够促进紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，进一步研究发现，姜黄素促进紫杉醇抗肿瘤作用可能与EGFR 信号通路有关.

综上，本研究结果初步表明姜黄素能够促进紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，为我们后续关于其可能的分子机制研究奠定了基础.

［1］Gao W，Chan J Y，Wei W I，etal.Anti-cancer effects of curcumin on head and neck cancers［J］.Anticancer Agents Med Chem，2012，12（9）：1110-1116.

［2］Guo H，Xu Y M，Ye Z Q，etal.Curcumin induces cell cycle arrest and apoptosis of prostate cancer cells by regulating the expression of IkappaBalpha，c-Jun and androgen receptor［J］.Pharmazie，2013，68（6）：431-434.

［3］Li Y，Zhang S，Geng J X，etal.Curcumin inhibits human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation through regulation of Bcl-2／Bax and cytochrome C［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（8）：4599-4602.

［4］Cretu E，Trifan A，Vasincu A，etal.Plant-derived anticancer agents-curcumin in cancer prevention and treatment［J］.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2012，116（4）：1223-1229.

［5］Cai J，Chen S，Zhang W，etal.Paeonol reverses paclitaxel resistance in human breast cancer cells by regulating the expression of transgelin 2［J］.Phytomedicine，2014，21（7）：984-991.

［6］Samuels T L，Pearson A C，Wells C W，etal.Curcumin and anthocyanin inhibit pepsin-mediated cell damage and carcinogenic changes in airway epithelial cells［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，2013，122（10）：632-641.

［7］Dhule S S，Penfornis P，He J，etal.The combined effect of encapsulating curcumin and C6 ceramide in liposomal nanoparticles against osteosarcoma［J］.Mol Pharm，2014，11（2）：417-427.

［8］Meng J，Li Y，Camarillo C，etal.The anti-tumor histone deacetylase inhibitor SAHA and the natural flavonoid curcumin exhibit synergistic neuroprotection against amyloid-beta toxicity［J］.PLoS One，2014，9（1）：e85570.

［9］Chiang I T，Liu Y C，Hsu F T，etal.Curcumin synergistically enhances the radiosensitivity of human oral squamous cell carcinoma via suppression of radiation-induced NF-kappaB activity［J］.Oncol Rep，2014，31（4）：1729-1737.

［10］Zhan Y，Chen Y，Liu R，etal.Potentiation of paclitaxel activity by curcumin in human breast cancer cell by modulating apoptosis and inhibiting EGFR signaling［J］.Arch Pharm Res，2013，37（8）：1086-1095.