Wnt通路及抑制因子对黑素细胞调控作用的研究进展

王辉 王千秋 林彤

Wnt通路及抑制因子对黑素细胞调控作用的研究进展

王辉 王千秋 林彤

Wnt信号通路包括经典通路和非经典通路，主要由Wnt配体蛋白、细胞膜上受体、胞质内信号转导和核内转录调控等部分组成，与肿瘤、骨质疏松、衰老、退化障碍等多种人类疾病有关。Wnt蛋白及其下游的信号因子通过不同机制调控了黑素细胞增殖、迁移、分化和黑素的合成过程。经典通路Wnt3a和非经典通路Wnt5a是影响黑素细胞黑素合成的重要配体蛋白，小眼畸形相关转录因子影响细胞核内的转录调控。Wnt蛋白抑制因子通过对Wnt通路的拮抗作用也参与了对黑素细胞功能的调控。

黑素细胞；Wnt信号通路；抑制因子，免疫

Wnt基因的命名最早是由小鼠乳癌原癌基因（Int）及果蝇无翅基因（wingless）合并而成，Wnt基因产物为Wnt信号通路的启动蛋白。Wnt信号通路主要由Wnt配体蛋白、细胞膜上受体、胞质内信号转导和核内转录调控等部分组成，其调节转录辅助因子β连环蛋白（catenin）的稳定性，与肿瘤、骨质疏松、衰老、退化障碍等多种人类疾病有关［1］。从细胞外配体蛋白、细胞内信息分子、Wnt通路抑制因子方面就Wnt通路及抑制因子对黑素细胞的生长及功能的调控作用的进展作一概述。

1 细胞外配体蛋白

Wnt通路包括经典通路（β连环蛋白依赖通路）和非经典通路（β连环蛋白非依赖通路）。前者经Wnt3A/β连环蛋白信号转导，影响细胞增殖、发育和组织代谢相关靶基因表达以及肿瘤的发生；后者主要由Wnt5A与胞膜受体卷曲蛋白及受体酪氨酸激酶样孤核受体2（Ror2）结合，引发下游信号转导，调控细胞骨架形成、细胞的极性、细胞间黏附和迁移［2］。Wnt蛋白家族包括 Wnt1 类和 Wnt5a类，前者主要有Wnt1、Wnt3a等，它们活化经典通路；后者主要有Wnt4、Wnt5a等，可激活非经典通路。

在参与调控经典通路的Wnt蛋白中，对黑素细胞功能影响最大的是Wnt1和Wnt3a，其参与了黑素细胞的发育，具有内皮素依赖性，促进黑素细胞数量增加［3］，但该蛋白对已成熟的黑素细胞的作用尚未阐明。Guo等［4］认为，Wnt3a对成熟黑素细胞的增殖有抑制作用，使有丝分裂G1期细胞数增加，进入S期的细胞减少，却对黑素细胞的功能有促进作用，使小眼畸形相关转录因子（MITF）及其下游的基因表达增加，显著增加酪氨酸酶活性，促进黑素合成。Takeda等［5］认为，Wnt3a这种作用使β连环蛋白在胞质内积累增多，并进入细胞核中与淋巴样增强因子结合，进而启动下游信号转导而发挥作用的。

作为非经典途径的代表分子，Wnt5a促进黑素肿瘤的发生、侵袭和转移。此外，还抑制黑素瘤中肿瘤相关抗原的产生。Wnt5a在黑素瘤中的作用已受到重视，但Wnt5a在正常黑素细胞中的功能尚不清楚。Zhang等［6］认为，Wnt5a不仅能抑制黑素细胞的增殖，还能够通过下调色素形成相关基因的表达减少黑素的合成，这种作用是通过与Ror2结合介导的。进一步研究发现，Wnt5a对Ror2及下游因子表达的促进作用呈时间依赖性，在转染Wnt5a 24 h后可发现c-Jun氨基末端激酶（JNK）mRNA的高表达，在48 h后恢复正常。提示Wnt5a可以通过Wnt5a/Ror2/JNK途径减少黑素的合成。Kang等［7］对黄褐斑的皮损区及皮损周围皮肤进行检测，发现黄褐斑皮损处Wnt5a明显增多，提示Wnt5a可能促进黑素细胞黑素的生成，与Zhang的结论相反。Wnt5a在正常黑素细胞和在黄褐斑皮损区黑素细胞中的作用并不一致，推测可能是因为黄褐斑皮损区黑素细胞与正常皮肤黑素细胞生物特性不同所致。Topol等［8］发现，Wnt5a不仅可以激活非经典途径，还可以通过抑制经典途径β连环蛋白的作用阻止经典途径的过度活化，起到抑制经典Wnt途径的作用，这种抑制作用可能不是通过抑制糖原合成激酶-3β组成的多蛋白复合物对β连环蛋白的磷酸化，而是通过泛素连接酶2和腺瘤性结肠息肉病蛋白对β连环蛋白的降解实现的。也有学者认为［9］，Wnt5a/Ror2途径对细胞内β连环蛋白的总量没有直接影响，但能够调节β连环蛋白磷酸化以及β连环蛋白从细胞质到细胞核的迁移，进而降低细胞质中内β连环蛋白的量，抑制经典Wnt信号途径。

2 细胞内信息分子

在经典通路中，Wnt/β连环蛋白信号转导通路的活化由细胞质中β连环蛋白的蛋白水平决定。正常状态下，细胞质中β连环蛋白由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达，泛素蛋白酶体是由轴蛋白、糖原合成激酶3β和大肠腺瘤息肉蛋白组成的多蛋白复合物，通过磷酸化标记蛋白，介导β连环蛋白分子的降解。Wnt蛋白通过与细胞表面受体复合物跨膜蛋白/共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白结合启动细胞内β连环蛋白聚集，β连环蛋白进入细胞核，与T细胞因子相互结合形成复合物，与其他转录辅助因子共同启动下游靶基因的转录。Kim等［10］研究发现，β连环蛋白通过调节蛋白激酶C（PKC）ζ及PKCδ的水平进一步影响树突形成相关蛋白，如Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）和细胞分裂周期蛋白4（Cdc4）来影响黑素细胞树突形成。高表达的β连环蛋白可以使 PKCζ升高而PKCδ降低，导致树突形成相关的蛋白水平下降，使黑素细胞树突变短、体积增大。

非经典途径比经典途径更为复杂，已发现的有：Wnt/Ca2+通路，为Wnt信号引起细胞内Ca2+水平增加，通过钙依赖性激酶、钙调蛋白和转录因子T淋巴细胞核转录因子发挥效应，该途径还可抑制Wnt/β连环蛋白通路；平面细胞极性通路，通过激活散乱蛋白（Dsh）下游区、GTP 酶、Rho、Rac、Cdc42 等，调节JNK信号发挥作用；Wnt/Ror2通路，主要为Wnt5A与细胞上Ror2、卷曲蛋白受体结合后，激活Rho、Rac和JNK等信号分子，调节细胞极性和迁移［11］。Ror2作为 Wnt5a的受体参与的 Wnt/JNK 通路的作用和对经典途径的抑制，但Ror2与其他受体成分相互作用的机制尚不清楚。研究认为，Wnt5A通路激活后，Ror2可以通过胞外富含半胱氨酸的结构域与Fz7结合形成受体复合物，进一步调节下游的Dsh及启动子活化蛋白1，Ror2/卷曲蛋白受体复合物通过调节Dsh的磷酸化在Wnt5a/Rac1/活化蛋白1通路中发挥重要的作用［12］。

在细胞核内转录调控的研究中，MITF是调节黑素细胞黑素合成的最重要的转录因子，对黑素细胞发育，功能和生存起了重要的调控作用。酪氨酸酶是黑素合成的核心调节酶，其基因启动子都含有一个“M-box”结构，MITF可与该结构结合，从而反式激活相应基因的表达。研究发现，MITF能够调节控制较多细胞过程，但同时又受许多不同的细胞信号途径和转录因子的影响［13］。在黑素细胞中，一方面可以指导酪氨酸酶基因家族在黑素细胞中的特异性表达，另一方面参与外界刺激对黑素细胞黑素生成的调控，如细胞外的Wnt信号蛋白家族［14］、转录因子性别决定区 Y 框蛋白 9［15］、环氧合酶 2［16］等对黑素细胞作用的调控都是通过调节MITF表达实现的。Bellei等［17］认为，α促黑素细胞素可作用于正常黑素细胞Wnt/β连环蛋白通路，促进黑素合成，这种促进作用也是通过MITF介导的。α促黑素细胞素作用于黑素细胞，使细胞内β连环蛋白增多，通过MITF表达上调刺激黑素生成增多。有研究应用含MITF siRNA制成的软膏治疗黄褐斑取得疗效，说明对MITF的阻断可以在多种细胞因子作用的下游发挥作用，为黑素细胞相关性疾病如黑素瘤的治疗有很好的提示作用［18］。在黑素细胞相关疾病的诊断中，常用S100蛋白和HMB45作为黑素细胞的标记物，S100蛋白敏感性高，但缺乏特异性，HM B45特异性较强，但敏感性较低。有研究发现，MITF标记可作为评价表皮内黑素细胞增殖和定量检测色素性疾病中黑素细胞数量的手段［19］。

3 Wnt通路抑制因子

Wnt通路的细胞外拮抗剂根据作用方式分为两类：一类是通过直接与Wnt蛋白结合抑制Wnt信号转导，包括分泌型卷曲相关蛋白家族、Wnt抑制因子1等；第二类是通过结合Wnt受体复合体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6抑制Wnt信号通路，目前仅发现Dickkopf家族属于此类。

WIF-1属于Wnt分子胞外抑制剂中的分泌型卷曲相关蛋白家族，通过直接与Wnt分子结合，抑制Wnt分子与受体细胞膜上的卷曲蛋白受体及辅助受体复合体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6形成三聚体复合物，从而抑制了Wnt信号的经典和非经典途径，影响黑素的合成［20］。WIF对经典通路和非经典通路均有影响，但具体的作用机制及最终促进还是抑制黑素细胞的色素生成尚无定论。在Kang等［7］对黄褐斑的皮损区及皮损周围皮肤进行的检测中，WIF1是皮损区20个明显表达上调的基因之一。研究认为，WIF-1主要由黑素细胞产生，黄褐斑患者皮损区较周围正常皮肤中WIF-1的表达升高，因此，WIF-1 可能促进黑素合成［21］。Kim 等［22］则认为，WIF-1主要由角质形成细胞和成纤维细胞分泌，黑素细胞中基本检测不到，分泌后作用于黑素细胞，WIF-1表达的降低导致Wnt蛋白升高，使因磷酸化降解的β连环蛋白减少，作用于细胞核的β连环蛋白增多，促进了酪氨酸酶的表达和黑素小体的转运，导致黄褐斑。WIF-1可以抑制黑素合成，与Kang的结论相反。且在Kim等的研究中发现，皮损中WIF-1的表达与紫外线照射无关。黄褐斑皮损免疫组化检查与体外细胞实验示WIF-1表达不同，提示黄褐斑皮损中黑素生成的调节机制可能不同于体外培养的正常黑素细胞。

重组人 Dickkopf相关蛋白 1是 Dickkopf类Wnt拮抗剂，主要由成纤维细胞分泌，与其他Wnt通路抑制因子不同，其不与Wnt蛋白相结合，而与LRP5/6结合发挥作用，主要抑制经典通路，对非经典通路无抑制作用［23］。在生理情况下，DKK1主要由成纤维细胞分泌，掌跖部皮肤成纤维细胞中的表达高于非掌跖部皮肤，DKK-1通过调节黑素中Wnt/β连环蛋白/MITF信号通路抑制黑素细胞的生长和黑素的产生，因此，角质层较厚的掌跖皮肤色素往往较浅。进一步的研究表明，DKK1的高表达导致的黑素细胞中色素生成减少是通过下调β连环蛋白和糖原合成酶激酶3β的表达和增加磷酸化的糖原合成激酶3β和PKCα完成的［24］。DKK1不仅影响黑素细胞的增殖和分化，还抑制黑素颗粒由黑素细胞向角质形成细胞的转运［23］。蛋白酶激活受体2是有7个跨膜G蛋白连接的受体，由角质形成细胞表达，黑素细胞不表达，在调节黑素小体转运中具有重要作用，蛋白酶激活受体2的激活可增加角质形成细胞对黑素小体的摄取。DKK1可以抑制角质形成细胞生成蛋白酶激活受体2，减少黑素颗粒由黑素细胞向角质形成细胞的转运。

综上所述，Wnt通路及抑制因子对黑素细胞的调控机制复杂，经典与非经典通路在黑素细胞发展的不同时期发挥不同的作用并相互影响。深入探索其调控机制并对其进行干预对临床色素性疾病的治疗具有意义。

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Regulation of melanocytes by Wnt signaling pathways and their inhibitory factors

Wang Hui,Wang Qianqiu,Lin Tong.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Wnt signaling pathways include a canonical pathway and a noncanonical pathway,and are composed mainly of Wnt ligands,receptors on cellular membrane,cytoplasmic signal transduction molecules and nuclear transcriptional factors.They are associated with a variety of human diseases,such as tumor,osteoporosis,senescence and degenerative disorders.Wnt proteins together with their downstream effectors regulate cell proliferation,migration,differentiation and melanin synthesis through different mechanisms.Both the canonical Wnt3a and noncanonical Wnt5a ligands are important ligands influencing melanin synthesis in melanocytes.Microphthalmia-associtated transcription factoraffects nucleartranscriptionalregulation.Moreover,Wnt inhibitory factors participate in the regulation of melanocyte function by counteracting Wnt signaling pathways.

Melanocytes;Wnt signaling pathway;Suppressor factors,immunologic

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.019

江苏省自然科学基金（BK2012507）

210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所

林彤，Email:ddlin@hotmail.com

本文主要缩写：Ror2：受体酪氨酸激酶样孤核受体2，MITF：小眼畸形相关转录因子，JNK：C-Jun氨基末端激酶，PK：蛋白激酶

2014-05-04）