黄连解毒汤组方在体外对白念珠菌生物膜的影响

张新研

（辽宁省抚顺市中医院检验科，抚顺 113008）

近几年的调查结果显示，白念珠菌为一种条件致病菌，是引起院内感染的常见菌种，并且感染发生率有逐年增加的趋势。经分析出现这一现象的主要原因为该菌很容易产生生物哦，并且生物膜的形成很容易引起药物疗效的打折。现阶段临床上西药抗白念珠菌生物膜的研究获得了一定的成效，而对于中药抗生物膜的研究报道则相对较少。黄连解毒汤在中医临床上属于常用的清热解毒基础方，主要功效为清热解毒、清热化湿，为对病原菌感染进行治疗的常用方药。本次研究中出于对黄连解毒汤和单味药在体外对白念珠菌生物膜的影响进行对比分析，为今后的研究与临床工作提供有价值的参考信息的目的，采取MTT法对白念珠菌的悬浮菌、生物膜对黄连解毒汤、单味药的敏感性进行评价，结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 菌株为20株白念珠菌。实验药物包括：黄连解毒汤。按照国家中医药管理局统一组织编审的普通高等教育中医类规划教材《方剂学》中的药物组成，复方与其单味药黄柏、黄芩、黄连、栀子。复方与单味药均水煎两次后，合并浓缩至100%浓度的药业，离心处理取上清滤过除菌，在4℃条件下保存备用。

培养基包括：RPMI1640培养基，YPG培养基以及沙氏培养基。

实验试剂包括：结晶紫，MTT，DMSO。是均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

实验仪器包括：318-酶标仪，96孔平板，倒置显微镜，均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2 .1 MIC的测定 以NCCLS的M27-A方案为依据，将100 μl的0.5×103～2.5×103个细胞/ml菌体混悬液加入至96孔板中，96孔板中事先已经加入而被稀释浓度的药物，在37℃条件下培养48小时，将无菌生长的最小药物稀释度作为个菌株的最低抑菌浓度。

1.2 .2 白念珠菌生物膜的制备 将所得到的白念珠菌在YPG培养基中进行接种，在37℃摇床过夜培养后对菌体进行收集，经RPMI1640培养基稀释后，对菌液浓度调整为1×106个细胞/ml。取100 μl的菌悬液在96孔板中接种，在37℃条件下培养24小时后，保证白念珠菌能够完全在平底的96孔板基底表面黏附，从而形成白念珠菌生物膜结构，倒置显微镜下对白念珠菌生物膜的形成进行鉴定。

1.2.3 SMIC的测定 在形成生物膜后，将培养基以及悬浮菌弃去，经PBS进行反复清洗3次，将药物按照两倍稀释后加入到各孔中，连续培养48小时，MTT法对抑制生物膜50%以及90%的药物浓度进行检测。而后将含有MTT的培养基弃去，经PBS反复清洗3次，佳儿DMSO100μl，连续振荡5分钟后，在酶标仪490 nm波长条件下对吸光度进行检测。将未加药物的孔作为对照组。

1.2 .4 预处理96孔板作用的观察 采取无菌PBS将黄连解毒汤以及各单味药按照而被连续稀释后加入到96孔板中，每孔200μl，在4℃条件下过夜保存。将药物弃去后，经PBS清洗1次，每孔中加入菌液100μl，在37℃条件下连续培养24小时，将孔内的菌液吸出，PBS反复清洗3遍，MTT法对吸光度进行检测。

1.3 数据处理 本次实验过程中，实验结果均采取Graphpad Prism 4.03统计学软件student’s检验，所有实验均重复3次取平均值。

2 结果

2.1 MIC和SMIC检测结果比较 经研究发现，黄柏、黄芩对白念珠菌悬浮菌的MIC50、MIC90以及对白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90与黄连解毒汤比较无明显差异；而黄连MIC50、MIC90以及对白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90与黄连解毒汤比较发生明显降低，并且低于黄柏和黄芩，见表1。

表1黄连解毒汤组方对白念珠菌的MIC以及念珠菌生物膜SM IC检查结果统计 （mg/m l）

2.2 96 孔板预先药物包被对白念珠菌生物膜的影响经统计发现，与对照孔比较，复方、单味黄连、黄柏、黄芩的药物浓度在达到≥6.25 mg/ml时，药物预先包被96孔板对白念珠菌生物膜形成均存在明显抑制作用，但存在明显差异，表现为黄柏、黄芩对体外白念珠菌生物膜抑制作用与黄连解毒汤效果相近，但黄连的抑制效果更加的明显。栀子无抑制效果，见图1。

图1药物预先包被对白念珠菌生物膜的影响

3 讨论

调查结果显示，随着临床上各种体内装置譬如说人工心脏瓣膜、静脉插管以及关节置换术等的广泛应用，使得真菌感染的发生率逐年升高，特别是白念珠菌感染情况日益严峻，抗菌药物的不合理应用也使得病原菌耐药性逐渐增强。研究中发现，在难治性真菌感染的病灶中多存在生物膜感染源，生物膜时附着在活组织或者是无活力组织表面的、由自身产生的细胞外基质包裹的有结构的菌细胞群体，为相对单个分散的悬浮状态菌细胞而言的微生物另外一种独特生存形式，生物膜的形成会使病原菌对抗菌药物的敏感性降低，甚至会产生耐药。

本次研究中出于对黄连解毒汤和单味药在体外对白念珠菌生物膜的影响进行对比分析，采取MTT法对白念珠菌的悬浮菌、生物膜对黄连解毒汤、单味药的敏感性进行评价，结果发现，黄柏、黄芩对白念珠菌悬浮菌的MIC50、MIC90以及对白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90与黄连解毒汤比较无明显差异；而黄连MIC50、MIC90以及对白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90与黄连解毒汤比较发生明显降低。与对照孔比较，复方、单味黄连、黄柏、黄芩的药物浓度在达到≥6.25 mg/ml时，药物预先包被96孔板对白念珠菌生物膜形成均存在明显抑制作用，黄柏、黄芩与黄连解毒汤效果相近，黄连的抑制效果更加的明显。栀子无抑制效果。这一结果与相关研究结果相似，由此证实，黄柏、黄芩对体外白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用，并与黄连解毒汤效果相近，黄连的抑制效果更加的明显。在今后的研究与临床工作中应对其给予足够的重视。

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