药用植物内生真菌研究进展

陈丽媛， 孙翠焕

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)



药用植物内生真菌研究进展

陈丽媛， 孙翠焕

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

药用植物内生真菌具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性,能够产生植物生长素、细胞激动素、赤霉素等促植物生长物质促进植物生长，从而使研究药用植物内生真菌成为寻找新型拮抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性药物的重要资源。本文对药用植物内生真菌的多样性、分离鉴定、产生的次生代谢产物及其功能等做一综述。

药用植物；内生真菌；多样性；刺激代谢产物

随着现代化进程的加快，全球性的环境污染也随之加剧，由致病细菌、真菌引起的各种疾病及大地威胁着人类的健康。为了降低化学合成药物带来的毒副作用，人们一直热衷于从药用植物中研制天然药物。药用植物是地球生物多样性中重要的组成部分，是人类在长期生产实践中认识和利用的、具有特殊化学成分和药理功效的植物资源的总称[1]。我国地域辽阔，气候复杂多样，具有丰富的药用植物资源，约有药用植物11 146种。药用植物生长周期长，药物提取量低，加之过度开采挖掘，有些药用植物资源已面临枯竭，给天然药物的规模生产带来困难，所以寻找更为高效的生物活性代谢物和更广阔的来源迫在眉睫[2]。植物内生真菌是指生活史的某一阶段生活在健康植物组织内部，并不引起宿主植物出现明显病症的一类真菌，包括那些在其生活史的某一阶段营表生的腐生菌，以及对宿主植物暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根真菌[3]。现今发现的内生真菌主要属于子囊菌(Ascomycetes)和半知菌(Deuteromycetes), 少数为担子菌(Basidiomycetes)。内生真菌具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性。本文就近年来药用植物内生真菌的多样性、分离鉴定、产生的次生代谢产物及其功能等做一综述。

1 药用植物内生真菌的多样性

研究表明，几乎所有被研究的植物体内均含有内生真菌[4]，根据内生真菌与宿主间的专一性分析，目前自然界至少有100多万种内生真菌[3]。谭小明等[1]基于近10年来已报道的可培养内生真菌，总结了国内外已报道的药用植物内生真菌的种类，研究人员从83科212种的药用植物组织(根、茎、叶、花、果实、叶柄、根茎等)中分离得到376属以上的内生真菌，涉及子囊菌、担子菌和无孢类群等，具有丰富的物种多样性。内生真菌的种类与数量在不同种的宿主内是不同的，而同一宿主在不同地区、不同季节及不同器官中等又各不相同。吴晓民等[5]从高山红景天根及根茎中分离获得内生真菌20株，初步鉴定为3目、5科、9属。其中镰孢霉属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)为优势种群。经TLC和HPLC法筛选得到1株可代谢产生活性物质红景天苷的内生真菌G5。李慧玲等[6]采用真菌形态鉴定并结合真菌ITS序列方法从广东湛江不同地区金银花植株内分离获得内生真菌17株，分别属于9个属17个种。结果表明不同组织部位的湛江金银花内生真菌在数量和种群组成中存在差异，表现出较丰富的多样性。侯晓强等[7]分别从河北安国及山东烟台两地的北沙参植株中分离到内生真菌137株，经ITS-rDNA序列分子鉴定分布在6纲8目11科21属。李强等[8]以西藏、吉林的新鲜野生翘鳞肉齿菌子实体为材料,分离培养出内生真菌26株，共分为14个属，从菌柄及菌盖中分离的真菌种类及数量均有差异，均具有潜在利用价值。张丽平等[9]以冬凌草不同器官(叶片、茎)为实验材料, 共分离出内生真菌256株，其中茎中113株,叶片中143株,PDA培养基共分离出内生真菌86株。曾茜等[10]从13株贵州黄花蒿植株内共分离出内生真菌122株，鉴定得到子囊菌门真菌共10目8科12属,担子菌门2目2科2属,接合菌门1目1科1属。

2 药用植物内生真菌的分离鉴定

目前多采用组织块分离法分离药用植物内生真菌。用次氯酸钠和酒精灭菌液对植物组织块表面进行消毒，再用真菌培养基培养，以达到分离和纯化目的。常规采用PDA培养基、WBA 培养基、Martin 琼脂培养基和燕麦粉琼脂培养基进行分离培养等，其中以PDA培养基效果最好。内生真菌的分离培养，关键是培养基的选择和植物组织块的严格消毒，以免混入杂菌。内生真菌的鉴定主要基于真菌形态学特征进行归类和鉴定，同时辅以生理生化、分子和生态学等特征，形态学鉴定主要根据孢子形态特征。谢凤颖[11]以白屈菜、土三七、毛茛等7种药用植物为分离材料，采用组织块表面消毒法，从中分离出27株可在体外培养的内生真菌。张伟等[12]采用不同消毒时间对沙冬青、老瓜头、甘草3种沙生药用植物内生真菌进行分离，结果表明：消毒3 min来消除非内生菌的影响，效果较好；同一植株分离出内生真菌的数量，以根部最多，其次是茎部，叶部最少。张影珍等[13]采用组织分离法分离新鲜防风根、茎、叶中的内生真菌,用形态学方法对其进行初步鉴定并使用滤纸片法来测定其次生代谢产物的抑菌活性。共分离得到32株内生真菌,分属于7目9科14属,并且具有不同程度的抑菌活性,其中菌株DR12、DL02、DS07和DS09具有较强的抑菌活性。防风内生真菌种类繁多,其次生代谢产物具有广泛的抑菌活性,从防风植物中分离内生真菌尚属首次报道。赵赟鑫等[14]自陕西省留坝县野生红豆杉分离1株高产紫杉醇的内生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10，以红豆杉内生真菌发酵的紫杉醇产量为指标，利用HPLC 法进行检测，筛选确定了发酵产紫杉醇的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是硝酸铵。曾宪军等[15]从药用植物麻花秦艽的根、茎和叶中分离出10株内生真菌，其中菌株GJ-01可产龙胆苦苷，可作为一种新的产龙胆苦苷的微生物资源。陈艳梅等[16]以蛇足石杉(Huperziaserrata)为材料,从其茎部分离纯化得到1株内生真菌,通过分子生物学技术将此内生菌鉴定为葡萄座腔菌属(Neofusicoccumsp.)，为进一步从植物内生真菌中挖掘有价值的天然活性产物提供参考。严亮等[17]采用微生物培养和分子生物学鉴定方法,从云南铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)根、茎和叶中分离得到41株内生菌, 根、茎和叶中的微生物种类和数量各不相同,只有Bacillusoceanisediminis、Bacillusberingensis和Bacilluslicheniformis三种菌株同时存在于根部和叶部。

3 药用植物内生真菌的次生代谢产物及功能

药用植物内生真菌的多样性使其次生代谢产物也具有多样性，从土壤微生物中得到的次生代谢产物为38%，而从内生真菌中得到的却多达51%[18]。内生真菌产生的具有抗肿瘤活性的化合物主要有生物碱、苯丙素、萜类、醌类化合物等。内生真菌还可以产生具有抗微生物活性的化合物，对人类及植物病原菌均具有较好的拮抗作用。朱妍妍等[2]对近年来从65 种植物中分离获得的74 株内生真菌产生的404 个次生代谢产物研究进行了分析归纳整理，并对其中194 个具有生物学活性的化合物结构和活性进行了综述。罗由萍等[19]从分离自海南东寨港红树林自然保护区的尖瓣海莲叶内获得1株菌株，经形态学及分子生物学鉴定为青霉属真菌，从该菌发酵液的乙酸乙酯萃取相中首次分离获得5个单体化合物，并首次获得了sclerotinin B 单晶结构。药用植物内生真菌还可以产生具有抗氧化活性的化合物。吴玉玲[20]采用组织分离法，利用传统PDA培养基和耐盐PDA培养基，对甘草耐盐内生真菌进行分离和纯化，共获得内生真菌108株，考察植物生长调节剂茉莉酸甲酯对活性菌株10-2-G-4发酵物中甘草查尔酮A的诱导调控作用，为寻找甘草可替代资源提供参考。王丽薇[21]从6种药用植物中获得112株内生真菌菌株，其中22株具有抗菌活性，并对其中6株抗菌活性较强、抗菌谱较广的内生真菌菌株的次生代谢产物进行活性跟踪分离,获得18个化合物。杨秀芳等[22]采用96孔板倍半稀释法对黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物中分离纯化得到的11个化合物的抑菌活性进行研究。测定获得了化合物对大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、尖孢镰孢菌、小麦赤霉病菌、苹果树腐烂病菌、番茄灰霉病菌的最小抑菌浓度(MIC)，结果表明黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物中有9个化合物对细菌和真菌有不同程度的抑制作用。李晓君等[23]以分离自山西太原健康紫苏茎秆的内生真菌为研究对象,采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离手段和现代光谱学技术,对其液体发酵产物的乙酸乙酯提取物进行了分离和结构鉴定;采用菌丝速率法,测试了分离化合物对番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌等植物病原菌的抗菌活性。从紫苏茎秆内生真菌Penicilliumsp.12Y25发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离鉴定了10个化合物,结果表明紫苏内生真菌Penicilliumsp.12Y25化学成分多样,部分化合物具有植物病原菌抗菌活性。阳辉蓉等[24]利用活菌菌饼法和滤纸片法研究筛选64株海南粗榧内生真菌对罗非鱼源无乳链球菌的抑菌活性,并对活性菌株的代谢产物化学成分进行初步测试，推测出对无乳链球菌有显著抑制作用的菌株可能含有甾体及三萜类物质，为深入研究内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的抑制及生物防治罗非鱼病害提供有益借鉴。曾苯等[10]从13植株贵州黄花蒿植株分离的122株内生真菌中，共有18株(14.8%)对病原菌具有较强的拮抗作用,其中以青霉属GZUCCZY0012菌株的抗病活性最为广谱,对6种病原真菌菌丝生长均具有较强的抑制作用,抑制效果为72.60%～94.86%。

4 问题与展望

植物内生真菌的分离与培养多采用组织块表面分离法，培养基不同所分离菌种的数量和多样性会存在一定的差异，分离药用植物内生真菌常用的培养基是PDA培养基。药用植物内生真菌的优势菌群会随季节变化而产生差异；非优势菌群或生长缓慢的内生真菌有时会因其生长空间受到限制，而无法分离获得。有相当一部分内生真菌无法在人工合成培养基上纯培养，材料表面消毒时间的长短也是至关重要的，过轻或过重都会影响对植物内生真菌的分离与培养，从而影响对其调查的准确性。时间过短，不能完全消除植物表面的微生物；时间过长，化学药剂将渗入植物体内，会杀死大量内生真菌。

内生真菌的形态学鉴定主要根据孢子形态特征，但是，常规人工培养条件下真菌只形成营养菌丝而不产生孢子或其他有性结构，而无法进行分类鉴定，必须诱导内生真菌产生孢子，人为设置各种恶劣环境如低温培养、扫刮菌丝、培养基更换、紫外诱导等，刺激目标菌株产生应激反应而产生孢子。尽管采用多种诱导方法，但仍然有大多数内生真菌无法诱导产生孢子，无法进行分类鉴定，只能根据培养特征进行形态型的划分，这种划分在分类学上并无多大意义。植物内生真菌产生的次生代谢产物含量很低，增大了分离和检测的难度，而内生真菌产生的与宿主植物相同或相似的活性成分的机制还不完全清楚[25]。

随着现代分子生物学各种技术手段的逐渐应用，不产孢内生真菌的分类鉴定难题在一定程度上得到有效解决。通过利用真菌通用引物(如ITS1/ITS4) 或针对特定真菌类型如菌根真菌的特殊引物(ITS1-OF/ITS4-OF)，研究人员直接从药用植物根、茎、叶内扩增真菌核糖体内转录区序列，鉴定了大部分形态学鉴定困难的内生真菌类群，同时也使得全面研究内生真菌多样性成为可能。随着高通量测序新技术在药用植物内生真菌多样性研究中的积极应用，人们发现了一部分未培养的内生真菌类群，更能全面地反映出内生真菌的多样性。

药用植物内生真菌的研究仍处于起步阶段，但其重要性已受到了极大关注。由于药用植物内生真菌及其次生代谢产物的多样性，使其成为新药物研发的宝库，将在很大程度上解决自然资源不足，实现可持续发展。对药用植物内生真菌研发的意义远大，前景十分广阔。

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Advances in Endophytic Fungi from Officinals

CHEN Li-yuan, SUN Cui-huan

(LiaoningAcad.ofMicrobiology,Chaoyang122000)

Endophytic fungi from officinals possess anti-tumor, anti-virus, anti-oxidation, and other activities, they could inspire plant auxin, cytokinin, gibberellin, and other plant growth promoting substances to enhance the plant growth and the studies on endophytic fungi have accordingly become important resources to search new type of active medicines for antagonistic, anti-tumor, anti-oxidation. In this article the diversities of endophytic fungi from officinals, isolation and identification, secondary metabolites they produced and their functions, and other aspects of were summarized.

officinals；endophytic fungi；diversities；stimulant metabolites

农业科技成果转化资金项目(国科办2013523)

陈丽媛 女，副研究员。主要从事应用微生物学研究。Tel：0421-2914613，E-mail:cly6585@163.com

2015-08-16；

2015-08-30

Q949.32

A

1005-7021(2015)05-098-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.018