产纳豆激酶菌中抗氧化菌株的多样性分析和鉴定

谢昕，吕晓腾，黄继翔

（1.徐州生物工程职业技术学院生物工程系，江苏徐州 221006；2.德州昂立达生物技术有限公司，山东德州 253000）

产纳豆激酶菌中抗氧化菌株的多样性分析和鉴定

谢昕1，吕晓腾2，黄继翔2

（1.徐州生物工程职业技术学院生物工程系，江苏徐州 221006；2.德州昂立达生物技术有限公司，山东德州 253000）

在产纳豆激酶菌株Bacillus sp.中分离筛选具有抗氧化能力的芽孢杆菌菌株，以豆粕为原料，以抗氧化性测试为筛选体系。对筛选得到的12个菌株的发酵上清液进行抗氧化稳定性测试，结果显示：HFBL261菌株抗氧化力残留最高，对HFBL261的表型形状和16S rDNA序列进行测定，该菌株鉴定为Bacillus subtilis。

芽孢杆菌菌株；抗氧化能力；多样性分析；鉴定

纳豆激酶是从发酵食品纳豆中提取出的一种溶纤酶，是一种催化血液纤维蛋白水解、使血管内血栓溶解的蛋白酶，除直接溶解血栓外，还具有水解凝血因子，激活内源性纤溶酶系统的作用，起到预防血栓形成的作用。纳豆激酶由纳豆发酵用菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生，在发酵纳豆过程中，用于纳豆发酵的枯草芽孢杆菌菌株除产生具有溶解血栓功能的纳豆激酶外，还可产生具有抗氧化及多种生理活性的大豆肽[1]。

机体在氧化过程中会产生多种自由基和其他活性氧，当自由基产生过多，超过机体对自由基的清除能力时，多余的自由基会导致DNA、脂质、蛋白质等生物分子的氧化损伤，这与机体衰老和多种疾病的发生与发展有密切联系[1]，抗氧化成分的开发是一个具有现实意义的研究方向。我们从纳豆发酵的枯草芽孢杆菌菌株中分离筛选具有抗氧化能力的芽孢杆菌菌株，以豆粕为原料，以抗氧化性测试为筛选体系，筛选优良菌株并进行鉴定，了解菌株的抗氧化特性并为功能性成分的开发提供菌株资源。

1 材料和方法

1.1 菌株的分离纯化

从纳豆发酵样品中，称取10 g样品，分散在90 mL无菌生理盐水中，剧烈震荡并梯度稀释后涂布LB平板，37°C培养48 h，挑取形态有差异的不同菌落在LB平板上多次划线纯化，镜检确认产生芽孢后将菌株接种至LB斜面保存备用。

1.2 菌株筛选

1.2.1 发酵上清液制备

本地市售豆粕（凯氏定氮法测含氮量7.46% （w/w），含水量8.72%（w/w））粉碎并过100目筛。豆粕培养基：豆粕粉10%（w/v），蒸馏水余量，300 mL锥形瓶装液量75 mL，1×105Pa灭菌15 min。所保存菌株在LB液体培养基活化48 h后以3% （v/v）接种量接种，37°C、180 r/min震荡培养24 h。发酵液12000 r/min离心10 min，取上清用于后续试验。

1.2.2 初筛1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）清除率测定

[2]有改动，发酵上清液1.0 mL与0.04 mol/mL DPPH乙醇溶液3.0 mL混合，避光静置30 min,12000 r/min离心10 min，测517 nm下吸光值。以无水乙醇为空白对照。清除率=（1-（A发酵上清-A发酵上清本底）/A无水乙醇空白）×100%。每个菌株重复测定3次。

1.3 复筛

1.3.1 羟基自由基（·OH-）清除率测定

按参考文献[3]有改动，稀释10倍的发酵上清液1.0 mL，与6 mmol/L FeSO40.3 mL，6 mmol/L水杨酸1.5 mL，双蒸水2.0 mL混合并摇匀，加入6 mmol/L H2O20.3 mL启动反应，室温静置10 min测510 nm下吸光值。以双蒸水为空白对照。清除率=（1-（A发酵上清-A发酵上清本底）/A双蒸水空白）× 100%，每个菌株重复测定3次。

1.3.2 超氧阴离子自由基（·O2-）清除率测定

按参考文献[3]有改动，取pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液3.0 mL，置于25°C水浴中预热20 min，与稀释10倍的发酵上清液1.0 mL和30 mmol/L邻苯三酚溶液0.6 mL混匀后，25°C水浴中保温5 min，加入1 mol/L HCl 0.5 mL终止反应，于420 nm处测定吸光值。以双蒸水为空白对照。清除率=（1-（A发酵上清-A发酵上清本底）/A双蒸水空白）× 100%。每个菌株重复测定3次。

1.3.3 总抗氧化力测定

使用钼酸铵法[4]，稀释10倍的发酵上清液1.0 mL，与0.6 mol/L H2SO4，28 mmol/L Na3PO4，4 mmol/ L钼酸铵溶液各1.0 mL混匀，95°C水浴60 min，冷却至室温，12000 r/min离心10 min后取上清，测695 nm吸光值，吸光值越大则样品抗氧化能力越强。每个菌株重复测定3次。

1.3.4 Fe3+还原能力测定

按参考文献[4]有改动，稀释10倍的发酵上清液1.0 mL，加入pH 6.6的0.2 mol/L磷酸缓冲液2.0 mL，10 mg/mL铁氰化钾2.0 mL，混匀，50°C水浴20 min，加入100 mg/mL三氯乙酸2.0 mL和0.1%（w/v）FeCl3溶液1.0 mL，混匀，测700 nm吸光值，吸光值越高表明还原能力越强。每个菌株重复测定3次。

1.3.5 Fe2+螯合率测定

按参考文献[5]有改动，稀释10倍的发酵上清液1.0 mL，加入1 mmol/L FeCl2溶液2.0 mL，5 mmol/L Ferozine溶液1.0 mL，混匀，室温下反应10 min，测562 nm吸光值。以双蒸水为空白。螯合率=（1-（A发酵上清-A发酵上清本底）/A双蒸水空白）×100%。每个菌株重复测定3次。

1.3.6 脂质过氧化抑制率测定

使用硫代巴比妥酸法[5]，稀释10倍的发酵上清液1.0 mL，加入0.4%（w/v）大豆卵磷脂溶液7.0 mL，加入10 mmol/L FeSO41.0 mL，混匀，37°C保温20 min，加入20%（w/v）三氯乙酸2.0 mL，5000 r/min离心10 min，取上清4.0 mL，加入0.8%（w/v）硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，混匀，沸水浴15 min，测532 nm吸光值。以双蒸水为空白。抑制率=（1-（A发酵上清-A发酵上清本底）/A双蒸水空白）×100%。每个菌株重复测定3次。

1.3.7 多肽浓度测定

使用双缩脲法[6]测定发酵上清液中多肽浓度，每个菌株重复测定3次。

1.4 发酵上清液抗氧化稳定性测定

按1.2.1方法制备的菌株发酵上清液，按1.3.3方法测总抗氧化力后，在50°C下静置存放，每隔2 d取样测总抗氧化力，共测7次。

1.5 数据分析

使用X-Cluster聚类分析软件[7]，对各方法所得数据进行聚类分析。

1.6 菌株鉴定

通过革兰氏染色和芽孢染色观察菌体形态，生理生化试验参照文献[8]，16S rDNA序列测定由华大基因技术有限公司完成。测序结果使用balstn比对初步确定种，利用有关种的公认标准序列数据，使用MEGA5.0对齐并做系统发育分析，参数为NJ法、Kimura2、Pairwise deletion。

2 结果和分析

2.1 菌株纯化与初筛

从43份纳豆样品中分离纯化产芽孢细菌247株，对其发酵豆粕上清液测定DPPH·清除率，除一个菌株的清除率为-1.8%外，另246个菌株的清除率在35.4%～96.6%之间，清除率数据分组统计见图1。未接种发酵的豆粕培养基上清的清除率为41.2%，与此相比，有97.2%（240个）的菌株发酵豆粕后可提高其对DPPH·的清除率，77.7%的菌株清除率在60%～80%范围内。按5%的比例挑选清除率最高的12个菌株，其清除率在86.2%～96.6%之间，进行复筛。

图1 菌株发酵豆粕上清液对DPPH·清除率的分布

2.2 复筛结果分析

表1 复筛菌株的抗氧化评价方法测量结果

对12个复筛菌株使用不同抗氧化性测定方法所得结果见表1，在初筛时对DPPH·有高清除率，而在另外5种抗氧化性评价方法中表现出不同的抗氧化能力。菌株发酵上清液的多肽浓度在1.94～10.46 mg/mL之间，差异较大。提示12个菌株在抗氧化能力和有效成分组成上存在差异，且抗氧化能力并不完全来自发酵过程中降解豆粕蛋白质产生的多肽。

7种抗氧化性评价方法结果及与多肽浓度间的相关系数见表2，只有总抗氧化力与·OH-清除率，·O2-清除率之间具有显著、极显著线性正相关，脂质过氧化抑制率与多肽浓度间有极显著线性负相关。对表2数据使用X-Cluster的UPGMA（线性）算法的聚类分析结果见图2，·OH-清除率、·O2-清除率、总抗氧化力、脂质过氧化抑制率因所得结果具有较高相关性而聚为一群，而DPPH·清除率、Fe2+螯合率、Fe3+还原能力三种方法的测试结果聚为一群，多肽浓度与此群在相关性上更高，但无统计意义。各方法和多肽浓度间的线性相关性表明，对于此12个菌株，发酵上清中多肽浓度并不是决定其抗氧化能力的关键性因素。

表2 不同抗氧化性测试方法及多肽浓度之间的相关系数

图2 不同抗氧化评价方法所得结果和多肽浓度的聚类分析

对表1数据使用X-Cluster进行聚类分析，算法参数为标准差标准化、夹角余弦系数、UPGMA（线性），结果见图3。在夹角余弦系数为0（表示无任何相关性）水平上分为4个类群。类群1包括HFBL206、HFBL241两个菌株，特点是DPPH·清除率相对较高，·OH-清除率、·O2-清除率、总抗氧化力、多肽浓度中等，类群2包括HFBL230、HFBL126等4个菌株，分为a、b两个小群，HFBL126所在小群a的·O2-清除率、总抗氧化力、Fe3+还原能力高于HFBL230所在小群b，但DPPH·清除率和多肽浓度低。类群3、类群4与类群1、类群2的主要差别为·OH-清除率、·O2-清除率较低。类群3与类群4相比，DPPH·清除率、Fe3+还原能力、多肽浓度较高，而·O2-清除率、总抗氧化力较低。菌株的分群结果提示不同类群的菌株所产生的抗氧化成分在抗氧化机制和种类上具有多样性。

2.3 抗氧化稳定性

图3 菌株的聚类分析结果和各类群在测试方法上的数值范围

12个菌株发酵上清液在50°C下存放14 d内的总抗氧化力均呈下降趋势，见表3，活性保存率（%）在69.1%～90.4%之间，其中HFBL234菌株活性保存率最高，而HFBL261菌株的发酵上清存放14 d后的总抗氧化力数值为1.141，在12个菌株中最高。

表3 菌株上清在50°C下存放14 d前后总抗氧化力变化

2.4 菌株鉴定

对各评价方法所得结果进行标准差标准化后求和作为菌株的评价标准，并综合考虑发酵液的气味、色泽等因素，HFBL261菌株的综合性能最佳，对该菌株进行鉴定。Bacillus sp.HFBL261的表型特性见表4。其16S rDNA序列分析结果见图4，与B.subtilis的相似度在99.5%以上。综合以上结果，鉴定为B.subtilis。

表4 Bacillus sp.HFBL261表型形状

图4 基于16S rDNA序列构建的Bacillus sp.HFBL261与相关菌株的系统发育树

3 讨论

以抗氧化为目标对纳豆发酵菌株中分离的芽孢杆菌进行筛选，在初筛中有97%的菌株可提高豆粕对DPPH·的清除率。其他研究认为大豆或豆渣经以芽孢杆菌发酵后，其抗氧化能力均有显著提高[9-11]，提示以大豆及其加工产品为底物进行发酵后产生抗氧化成分可能是芽孢杆菌的普遍特性。

目前已报道的抗氧化评价方法众多，但受限于生物体代谢系统的复杂性和成分多样性，并未有公认的、可准确反映一种样品在体内抗氧化能力的标准方法，真实反映其抗氧化能力非常困难[12]。目前的普遍观点是应选取多种基于不同机制的方法进行分析，尽可能得到客观可靠的结果。在众多抗氧化能力评价方法中，总氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法被认为是一种生物相关性较高的方法[13]，但该方法对设备要求高且试剂较贵，不易普及。对ORAC法和其他方法进行的比较研究显示，ORAC法与DPPH法具有较高的相关性[14]，因此我们在菌株初筛时选择更易操作的DPPH法对菌株进行筛选。

对12株具有高DPPH·清除率的菌株进行复筛，使用多种方法评价其发酵豆粕上清液的抗氧化能力，在另5种方法中，对不同自由基的清除率或抗氧化力的差别很大，如HFBL252菌株，对DPPH·的清除率高达94.4%，对·OH-、·O2-清除率却仅为35.5%、14.6%。同一种样品在不同评价方法中的差异来源于不同评价方法在反应原理和底物上的差异，不同评价方法间缺乏可比性。Yang 等[15]对多种抗氧化肽使用不同评价方法进行了比较，Pleurain-A1型肽可清除·ABTS+、·NO却没有DPPH·清除活性，Pleurain-J1型肽可清除·ABTS+、DPPH·，但无·NO清除活性，而Antioxidin-RP1型肽对三种自由基均有较高清除率。豆粕发酵上清液作为一种成分复杂的混合物，可能含有多种类别的抗氧化成分，如多肽、异黄酮等，而一类成分中又存在多种物质，如不同序列的肽段，使其无法用单一机制解释。不同的抗氧化成分在各种评价方法上表现出的差异使各方法间具有低相关性。在本实验中，除总抗氧化力与·OH-、·O2-清除率之间有显著、极显著线性正相关，脂质过氧化抑制率与多肽浓度间有极显著线性负相关外，其他方法所测结果间无显著的线性相关性，表明需要使用多种评价方法来尽可能客观的体现一种样品的抗氧化能力。

芽孢杆菌是一个蛋白酶活力较高的类群，发酵大豆、豆粕等富含蛋白质的基质后，产物中富含多种功能性肽，因此多肽浓度与功能性间可能存在相关性。陈洁梅等[16]使用Bacillus sp.JM3固态发酵豆粕，认为多肽浓度与总抗氧化活性间有良好相关性（R2=0.8604）。我们对12个菌株的测试结果表明，多肽浓度与任何一种抗氧化评价方法间均无显著的正相关，最高的相关性数值为与DPPH·清除率之间的0.217，多肽浓度与脂质过氧化抑制率呈极显著线性负相关，·O2-清除率、总抗氧化力呈负相关但不显著，如HFBL234菌株，发酵上清中多肽浓度仅为1.94 mg/mL，但对DPPH·、·OH-、·O2-的清除率分别为89.9%、45.9%、49.2%，脂质过氧化抑制率为83.6%。认为该现象与芽孢杆菌类群的代谢多样性，以及我们所筛选菌株的多样性有一定关系，芽孢杆菌是一个代谢多样性较高的类群，除分解蛋白质产生多肽外，还可转化大豆或豆粕中的脂质、异黄酮等抗氧化成分，或是合成非多肽类的抗氧化成分。对12个菌株的聚类分析将其分为数个类群，在不同抗氧化性测试方法上的差异提示其所产成分的差异，不能确定其抗氧化性全部来自多肽。另一方面，并非所有的多肽都具有抗氧化性，结构决定功能，只有具有特定氨基酸序列的多肽才具有抗氧化性，例如Chen 等[17]从大豆蛋白酶解物中分离纯化出的抗氧化肽在N端富含Val、Leu、Ile、Pro等残基；抗氧化肽在总肽中的比例会影响多肽（总肽）浓度与抗氧化性之间的相关性。

芽孢杆菌对大豆中成分的分解和转化可产生多种抗氧化物质，如抗氧化肽、异黄酮类[18]、维生素E[19]等。作为一个种类多样、代谢多样性高的微生物类群，芽孢杆菌还可合成多种其他类型的抗氧化成分。袁剑锋等发现分离自新疆罗布泊沙漠的Bacillus sp.可产生具有抗氧化能力的均一组分糖蛋白，能够清除·OH-、·O2-，并抑制脂质过氧化；作为益生菌使用的B.coagulans RK-02在葡萄糖无机盐培养基中可产生一种含有岩藻糖单元且糖链结构罕见于革兰氏阳性菌的胞外多糖，在多种抗氧化测试方法中表现出良好的抗氧化性[20]。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化物质，但大多数革兰氏阳性菌细胞内谷胱甘肽含量很低，而芽孢杆菌细胞内一种含有L-半胱氨酸单元的小分子硫醇化合物Bachillithiol含量较高，可作为谷胱甘肽的替代物参与氧化还原过程并发挥抗氧化作用[21]。Paenibacillus elgii B69可产生含有2,3-二羟基苯甲酸和氨基酸单元的儿茶酚类铁载体成分[22]，认为因其Fe3+结合能力和酚羟基反应性而具有抗氧化能力。

对筛选的12个菌株的聚类分析将其在0～0.2水平上分为4～5个类群，不同类群在不同的抗氧化性评价方法上表现各异，其结果与多肽浓度无相关性或为负相关，提示其发酵豆粕产生的抗氧化成分在作用机制和类型上的多样性和差异，认为一些菌株产生非多肽类抗氧化成分的可能性很大，对其中活性成分的分离鉴定将是今后的研究方向。

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（责任编辑：朱小惠）

Diversity analysis and identification of strains with antioxidantive property from Bacillus sp.

XIE Xin1,LV Xiaoteng2,HUANG Jixiang2
(1.Department of Bioengineering,Xuzhou Engineering Vocational and Technical College,Xuzhou 221006,China; 2.Onlystar Biotechnology Co.,LTD.,Dezhou,253000,China)

This paper aimed to screen and isolate Bacillus strains producing antioxidantive ingredients.The soybean meal was used as raw material and the antioxidant assay methods were used to screen the targeted strains.The antioxidation stability test on fermentation supernatant of the twelve screened strains showed that strain HFBL261 possessed highest residual antioxidant capacity and was identified as Bacillus subtilis by phenotypic characterization and 16S rDNA sequence.

Bacillus strains;antioxidant capacity;diversity analysis;identification

Q93

A

1674-2214（2015）01-0012-07

2014-10-14

江苏高校优势学科建设工程资助项目（ZYB94）

谢昕（1981—），女，江西高安人，讲师，研究方向为微生物药物学，Email：xx822000@163.com.通信作者：黄继翔工程师，Email：programan9527@163.com.