红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R 表达的影响

张新胜 程 航 徐曼曼 祝彼得 (河南师范大学生命科学学院，新乡 453007)

既往研究表明，红景天的提取物对γ 射线辐射损伤或环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制造血祖细胞有促进增殖的作用［1］。我们以往的研究也表明，一定剂量的红景天苷能促进骨髓抑制贫血小鼠骨髓造血功能的恢复［2］。骨髓具有丰富的神经支配，进入骨髓的神经分支后分布于血管外膜、造血细胞之间以及骨髓窦等处，提示神经终末释放的物质可能参与造血微环境的形成［3］。骨髓中最富有代表性的终末之一是释放SP 的神经终末。SP 是一个哺乳类普遍存在的含11 个氨基酸的神经肽，属于结构上相关的速激肽(Tachykinins，TKs)家族，其广泛分布于神经系统和免疫系统［3-5］。SP 不仅与心血管、神经、呼吸和免疫系统的许多生理过程密切相关［5］，似乎还具有刺激造血的作用［6］。目前SP 及其受体NK-1R 是否参与红景天苷促进骨髓造血功能恢复的过程尚不清楚。本研究采用骨髓抑制贫血小鼠模型，用免疫组织化学方法和RT-PCR 技术观察了红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞SP 及其受体NK-1R 表达的变化，探讨SP 及其受体NK-1R 在促进骨髓造血恢复中的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与主要试剂 红景天苷(纯度为95%)，成都明波生物技术有限公司提供;环磷酰胺为上海华联制药有限公司产品;60Coγ 源由四川省农业科学院生物技术核技术研究所提供;SP 和NK-1R 多克隆抗体、免疫组化检测试剂盒、DAB 显色试剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司;RNAiso Reagent、RT-PCR Kit 购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 实验动物 8～12 周龄BALB/c 健康雄性小鼠40 只，体质量18～22 g，四川大学华西实验动物中心提供。

1.3 骨髓抑制贫血动物模型的制备 参照本实验室常规方法造模［2］。具体方法是:小鼠经2.0Gy60Co 照射后的第4 天开始每天腹腔注射环磷酰胺(CTX)40 mg/kg(于临用前配制)、氯霉素50 mg/kg，连续给药3 d 完成模型制备。

1.4 动物分组与给药 将小鼠随机分为对照组、模型组、红景天苷低剂量、中剂量和高剂量组，每组8只。除对照组外，其他4 组均进行造模。小鼠造模完成的第2 天，红景天苷低剂量、中剂量和高剂量组开始腹腔注射红景天苷(无菌生理盐水配制)，剂量分别为10、20 和40 mg/kg，每只小鼠每天腹腔注射0.2 ml。对照组和模型组每只小鼠每天腹腔注射0.2 ml 的生理盐水。连续注射7 d。

1.5 外周血细胞计数 在末次给药(或给生理盐水)后24 h，经小鼠眼眶后静脉丛采血20 μl 稀释后用HS-18 型全自动血细胞分析仪进行血常规检测。

1.6 SP 及其受体NK-1R 表达检测 采用免疫组织化学法。在末次给药(或给生理盐水)后24 h(造模后第8 天)分别取各组小鼠的股骨，4%的多聚甲醛固定，EDTA 脱钙，常规制作石蜡切片。按SABC检测试剂盒步骤分别检测SP 及其受体NK-1R 的表达。PBS 替代一抗做阴性对照。

1.7 SP 及其受体NK-1R mRNA 表达检测 采用RT-PCR 技术。在末次给药(或给生理盐水)后24 h(造模后第8 天)分别取各组动物的股骨，用适量的IMDM 培养基分别冲出各组动物的骨髓，离心(1 000 r/min，5 min，4℃)后取骨髓细胞。按RNA提取试剂说明书提取骨髓细胞的总RNA。用紫外分光光度计测定样品A260 及A280，根据A260 值将各个样品总RNA 稀释至相同浓度。各取2 μg 总RNA 按RT-PCR 试剂盒说明进行操作逆转录合成cDNA，等量取cDNA，用相对应的引物对SP 和NK-1R 的基因片段进行扩增。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列:SP:上游5'-GTTTCCACTCAACTGTTTGCAG-3'，下 游 5'-CTCTTTTGCCCATTAGTCCAAC-3'，扩增片段长度295 bp;NK-1R:上游5'-CCACAAGAGAATGAGGACAGTG-3'，下游5'-CATAGCCAATCACCAGCAGAG-3'，扩增片段长度467 bp;3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH):上游5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3'，下游5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，扩增片段长度289 bp。PCR 反应参数:94℃，2 min;94℃变性，30 s;退火(上述3 个引物扩增时的退火温度分别为55℃、55℃和54℃)30 s;72℃延伸，1 min，扩增35 循环;72℃，10 min。取5 μl PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用GoldVeiw DNA 染料染色。

1.8 图像分析方法 采集的SP 和NK-1R 免疫组织化学染色图像，用Image-Pro Plus 分析软件进行图像分析，每张切片取5 个视野测定小鼠骨髓细胞SP和NK-1R 蛋白阳性产物的积分光密度值(IOD 值)，取平均值代表SP 和NK-1R 蛋白表达强度。琼脂糖电泳凝胶条带经BIO RAD Quantity one 4.4.0 图像分析系统采集电泳图像，并进行半定量分析，结果用各基因扩增条带光密度值与内参照GAPDH 光密度值的比值表示。

2 结果

2.1 红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠外周血的影响 外周血检测结果显示(见表1)，与对照组相比，模型组WBC、RBC 和HB 均明显降低。与模型组相比，低剂量、中剂量和高剂量红景天苷组均能明显升高外周血WBC 数，中剂量红景天苷组均能明显升高外周血PLT 数。各剂量红景天苷组对外周血RBC 和HB 未见明显的促进作用。

2.2 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R 表达的影响 免疫组织化学结果显示，在对照组、模型组和各剂量红景天苷组小鼠骨髓细胞中均检测到SP和NK-1R 表达，阳性产物为棕黄色颗粒。与对照组相比，模型组骨髓细胞中SP 表达明显降低(P＜0.05)，而各剂量红景天苷组骨髓细胞中SP 表达明显增强(P＜0.05)。与模型组相比，各剂量红景天苷组骨髓细胞中SP 表达明显增强(P＜0.05)，而且表达强度随用药剂量的增加而增强(见图1、2、表2)。在对照组和模型组中均有较微弱的NK-1R 表达，二者比较，无显著性差异(P ＞0.05)。与对照组或模型组相比，各剂量红景天苷组骨髓细胞中NK-1R 表达均明显增强，有统计学意义(P＜0.05)，而且表达强度随用药剂量的增加而增强(见图1、2、表2)。

表1 红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠外周血的影响(±s，n=8)Tab.1 Effect of salidroside on peripheral blood cells of bone marrow depressed anemia mice(±s，n=8)

表1 红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠外周血的影响(±s，n=8)Tab.1 Effect of salidroside on peripheral blood cells of bone marrow depressed anemia mice(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs low-dose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group.

图1 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 表达的影响(SABC，×400)Fig.1 Effect of salidroside on SP expression of bone marrow cells(SABC，×400)

图2 红景天苷对小鼠骨髓细胞NK-1R 表达的影响(SABC，×400)Fig.2 Effect of salidroside on NK-1R expression of bone marrow cells(SABC，×400)

表2 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R 表达的影响(±s，n=8)Tab.2 Effects of salidroside on SP and NK-1R expression of bone marrow cells(±s，n=8)

表2 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R 表达的影响(±s，n=8)Tab.2 Effects of salidroside on SP and NK-1R expression of bone marrow cells(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs lowdose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group.

表3 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R mRNA 表达的影响(±s，n=8)Tab.3 Effects of salidroside on SP and NK-1R mRNA expression of bone marrow cells(±s，n=8)

表3 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 和NK-1R mRNA 表达的影响(±s，n=8)Tab.3 Effects of salidroside on SP and NK-1R mRNA expression of bone marrow cells(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs lowdose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group;-.Not detected.

图3 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP mRNA 表达的影响Fig.3 Effect of salidroside on SP mRNA expression of bone marrow cells

图4 红景天苷对小鼠骨髓细胞NK-1R mRNA 表达的影响Fig.4 Effect of salidroside on NK-1R mRNA expression of bone marrow cells

2.3 红景天苷对小鼠骨髓细胞SP 及其受体NK-1R mRNA 表达的影响 RT-PCR 结果显示，在对照组、模型组和各剂量红景天苷组小鼠骨髓细胞中均检测到SP mRNA 的表达(见图3、表3)。与对照组相比，模型组和各剂量红景天苷组骨髓细胞中SP mRNA 表达明显增强(P＜0.05)。与模型组相比，各剂量红景天苷组骨髓细胞中SP mRNA 表达明显增强(P＜0.05)，而且表达强度随用药剂量的增加而增强。在对照组和模型组中均未检测到NK-1R mRNA的表达，而在红景天苷三个剂量组骨髓细胞中均检测到NK-1R mRNA 的表达，三者两两比较，差异显著，均有统计学意义(P＜0.05)，而且mRNA 表达水平随用药剂量的增加而升高(见图4、表3)。

3 讨论

骨髓从结构上可以分为两个密切相关的部分:造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)和造血微环境(Hematopoietic microenvironment，HM)。造血微环境是造血干细胞增殖、发育和分化的场所，造血微环境中的细胞应答不同的刺激可以引起一些可溶性因子如细胞因子、神经肽、神经营养因子等的产生，以支持造血［7，8］。造血调控的一个主要机制涉及到其与神经系统之间的双向通讯交流，神经递质可与细胞因子形成一个复杂的网络来调控造血［9］。SP 是TKs 家族的主要成员，其作为神经递质、神经调质或生长因子参与许多生理过程［10］。SP 在调节免疫应答方面的作用已被广泛研究，但在造血方面的研究少有报道。Kang 等［9］的研究显示，分布于骨髓中的SP 有2 种来源，一是来源于支配骨髓的神经，二是来源于骨髓细胞。Rameshwar 等［4］的研究显示，骨髓细胞既表达SP，也表达SP 受体NK-1R。SP 可通过与其优先受体NK-1R 之间的相互作用来发挥其刺激造血的作用［6］。在体外的一些研究发现，SP 具有刺激红系和粒系祖细胞增殖的作用，在缺乏外源性造血生长因子(Hematopoietic growth factors，HGFs)情况下，SP 单独使用，能够维持体外造血［6，11，12］。本研究中，我们用60Coγ 射线、环磷酰胺和氯霉素结合的方法处理小鼠制备骨髓抑制贫血小鼠模型，结果显示造模后模型组小鼠外周血WBC、RBC 和HB 明显降低，表明造模成功。本研究结果还显示，一定剂量的红景天苷对外周血WBC 和PLT的恢复有明显的促进作用，进一步证实一定剂量的红景天苷能促进骨髓抑制贫血小鼠骨髓造血功能的恢复［2］。在上述研究的基础上，本研究又观察了红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞SP 及其受体NK-1R 表达的影响。结果发现，对照组、模型组和各剂量红景天苷组小鼠骨髓细胞中均检测到SP 和NK-1R 的表达，而且对照组中检测到SP 和NK-1R表达的结果与Rameshwar 等［4］研究结果是一致的。造模后骨髓细胞中SP 表达明显降低，NK-1R 的表达虽然有所降低，但无统计学意义(P ＞0.05)。在各剂量红景天苷组骨髓细胞中SP 和NK-1R 的表达均明显增强，而且表达强度随用药剂量的增加而增强，表明红景天苷可以促进SP 和NK-1R 在骨髓细胞中的表达，而且有剂量依赖性。另外，RT-PCR 结果显示，在对照组、模型组和各剂量红景天苷组小鼠骨髓细胞中均检测到SP mRNA 的表达，这与上述免疫组化的结果相符。虽然有研究报道在未刺激的骨髓细胞中NK-1R 的表达低到检测不到的水平［13］，我们用免疫组化法还是在对照组检测到了较弱的NK-1R 的表达，但用RT-PCR 技术在我们目前使用的条件下未能检测到NK-1R mRNA 的表达，这也说明未刺激的骨髓细胞中NK-1R 的表达水平确实非常低。另外有研究表明，NK-1R 具有组织特异性调节特性，它在神经细胞呈现构成性表达，而在骨髓基质细胞可被诱导产生［9］。我们在造模组骨髓细胞中未检测到NK-1R mRNA 的表达，但在各剂量红景天苷组小鼠骨髓细胞中均检测到NK-1R mRNA 的表达，而且表达强度也随用药剂量的增加而增强，这个结果不仅与上述免疫组化的结果相符，也进一步表明红景天苷可诱导NK-1R mRNA 的表达。所以，无论是从蛋白质水平，还是从基因水平都反映出红景天苷能明显促进小鼠骨髓细胞中SP 及其受体NK-1R 的表达。该结果提示，红景天苷促进骨髓造血功能的恢复可能与SP 和NK-1R 的表达增强密切相关。

既往的研究还提示，SP 通过与其特异性受体NK-1R 相结合来发挥其生物学效应，从而导致骨髓细胞产生了一些与造血有关的细胞因子，包括IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF 和干细胞因子(Stem cell factor，SCF)［14］。SP 诱导产生的这些细胞因子又能激活骨髓细胞，使其通过一种自分泌和/或旁分泌的机制产生其他一些具有刺激造血作用的细胞因子［4］。SP与细胞因子之间的相互诱导，就形成了一个调控造血的网络，为造血干细胞的增殖、发育、分化和迁移营造了一个良好的环境。另外有研究显示，SP 在体外刺激造血的作用部分可被抗IL-1、IL-3、IL-6 和GM-CSF 的抗体所减弱［8］。这似乎表明SP 调控造血的生理作用，至少部分是通过骨髓细胞和HGFs的释放来起作用的。因此，本研究中，红景天苷可能通过促进小鼠骨髓细胞中SP 及其受体NK-1R 的表达，进而通过SP 与NK-1R 的特异性结合，导致骨髓细胞释放HGFs 来促进骨髓抑制贫血小鼠骨髓造血功能的恢复。

还有研究显示，SP 作为一种抗凋亡因子既可以保护培养的腱细胞免受TNF-α 诱导的凋亡［15］，又可保护骨髓细胞免受骨髓低氧引起的损伤［16］。在以往的研究中，我们发现红景天苷可通过升高小鼠骨髓细胞Bcl-2 的表达、降低Bax 的表达来保护骨髓细胞免受放、化疗引起的骨髓抑制性贫血小鼠骨髓细胞的凋亡［2］，而在本研究中发现，红景天苷可促进小鼠骨髓细胞中SP 的表达，所以红景天苷抗骨髓细胞凋亡的作用也可能有SP 的参与。

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