体外冲击波联合增强型纤维蛋白胶负载骨生长因子治疗兔骨不连的研究

喻绍顶 倪卫东 (重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016)

骨折是常见的创伤，而骨不连、骨折延迟愈合则仍然是临床上有待解决的难题。由于骨折后导致骨不连的成因复杂，观点众多，其治疗方法不一［1］。目前传统的治疗仍为植骨、内固定或外固定支架等有创治疗［1，2］。反复多次手术既增加患者痛苦，又加重病员经济负担，并可发生供骨区疼痛、感染等诸多手术相关并发症。因此，寻求一种更好的治疗方法成为骨不连治疗研究的重要课题。

20 世纪90 年代人们开始将体外冲击波(Extracorporeal shock wave，ESW)治疗应用于骨科疾病治疗，发现ESW 治疗有刺激成骨的作用，在治疗骨折、骨不连方面有较好的疗效［3，4］，但由于内脏器损伤、损伤大血管及神经等多种原因尚不能广泛应用。另外，冲击波能量选择是其受限的重要原因，能量过低达不到治疗的目的，能量过高则损伤较重［5］。因此，寻找一种弥补措施成为优化该疗法的追求目标。新近研究表明，骨形成蛋白(BMP)与bFGF 能够增强彼此的作用，加速了软骨的成熟和骨化［6］，二者在不同水平和不同环节上参与对骨诱导、骨形成过程的调节。另有实验研究提示，BMP 和血管内皮生长因子(VEGF)在骨愈合中对成骨有相互依赖及调控的作用［7］。我们推测是否联合治疗可以成为有效的治疗手段，是否可以减少体外冲击波能量的情况下，再通过联合应用骨形成蛋白、成纤维生长因子、血管内皮生长因子等综合治疗方法，同样可以更有效治疗骨不连。

兔性情温顺，便于饲养。同时，兔的骨骼转化速度快，约达到了人类的3 倍，因此可以在短期内观察骨折愈合时骨组织的变化，肱骨桡骨粗大，是制备骨折模型较为常用的动物［8］。因此，本课题主要采用兔制备桡骨模型，并行不同方案的治疗，包括单纯体外冲击波治疗，以及分别联合纤维蛋白胶、成纤维生长因子、血管内皮生长因子等治疗情况下，通过常规X 线摄片、组织形态光学检查及生物力学试验等方法检测冲击波联合药物治疗后的骨折愈合情况。

1 材料与方法

1.1 材料 纤维蛋白胶(FG):由广州倍绣生物技术有限公司提供，分为生物胶主体、主体溶解液、催化剂及催化剂溶解液4 部分。人重组血管内皮细胞生长因子(rhVEGF):由北京博奥森生物技术有限公司提供。重组骨形态发生蛋白2(rhBMP-2):由广州市达晖生物技术有限公提供。重组人碱性成纤维生长因子(rhbFGF):广东珠海东大生物技术公司产品。在纤维蛋白胶的溶液中各组分别加入的rh-VEGF、rhBMP-2、rhbFGF 的最终聚合物中，rhVEGF的浓度为0.5 mg/ml，rhBMP-2 的浓度为2.5 mg/ml，rhbFGF 的浓度0.5 mg/ml。普通级新西兰兔:体重约2.2～2.5 kg，由重庆医科大学动物中心［SCXK(渝)2012-0001］提供，实验地点位于重庆医科大学动物中心［SYXK(渝)2012-0001］。体外冲击波碎石机:由重医大附一院及冲击波实验室提供。该实验通过重庆医科大学实验动物伦理委员会同意。

1.2 动物分组 取48 只健康成年新西兰兔，雌雄不限，体重2.2～2.5 kg。随机分为A、B、C、D 四组，每组12 只兔，共48 只左侧桡骨模型，手术造成左侧桡骨缺损骨不连。实验分为A 组:12 只骨不连给予体外冲击波治疗;B 组12 只骨不连采用FG +体外冲击波治疗;C 组12 只骨不连采用FG/rhBMP-2/rhbFGF+体外冲击波治疗;D 组12 只骨不连采用FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+体外冲击波治疗。

1.3 手术方法 骨不连模型的制作:20 g/L 戊巴比妥纳30 mg/kg 兔耳缘静脉注射麻醉。俯卧固定于手术台上，褪毛消毒铺无菌巾。取前臂内侧纵行约3 cm 直切口。充分显露左侧桡骨中段，电锯造成约10 mm 节段骨缺损(带骨膜)，将骨碎屑冲冼干净，缝合伤口。A、B、C、D 四组标记分笼喂养，术后立即肌肉注射青毒素40 万U/只，连续3 d，不予外固定。2 个月后摄X 线片证实骨不连模型形成，骨折端硬化，骨折间隙清晰可见。

增强型纤维蛋白胶的制作:将纤维蛋白胶粉剂，配成浓度为40 mg/ml 纤维蛋白胶细胞悬液。将凝血酶加入已预热至37℃的氯化钙(40 mmol/ml)溶液中，浓度为50 U/ml。配制凝血酶(50 U/ml)、抑肽酶(8 000 U/ml)及氨甲环酸(20 mg/ml)复合液。在常温下将纤维蛋白胶悬浮液里滴入凝血酶、抑肽酶及氨甲环酸制成增强型纤维蛋白胶。将制成的增强型纤维蛋白胶分成A、B、C、D 四组。在C 组直接加入rhBMP-2 的浓度为2.5 mg/ml，rhbFGF 的浓度0.5 mg/ml 制备成纤维蛋白胶复合物。在D 组直接加入rhVEGF 的浓度为0.5 mg/ml，rhBMP-2 的浓度为2.5 mg/ml，rhbFGF 的浓度0.5 mg/ml 制备成纤维蛋白胶复合物。

治疗方法:采用能量为0.5 mJ/mm2级的冲击波(德国ESWL 冲击波机)对A、B、C、D 组进行治疗，冲击量为800 次，焦点聚焦范围1.5 mm2，在透视下调整冲击焦点，分别对骨不连远近端边缘进行冲击。A 组12 只兔采用体外冲击波治疗;B 组12只兔采用FG+体外冲击波治疗;C 组28 只兔采用FG/rhBMP-2/rhbFGF+体外冲击波治疗;D 组12 只兔采用FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+体外冲击波治疗。治疗后B 组、C 组、D 组分别在冲击波治疗后经皮肤直接注入纤维蛋白胶或复合物到骨折断端1次，每次在断端注入2 ml 纤维蛋白胶或复合物。采用组间及组内对照并作统计学分析。

1.4 效应指标和资料收集方法

1.4.1 X 线摄片检查 采用数码成像X 线机分别于冲击波治疗后第4、8 周摄A、B、C、D 组兔患肢正位X 线片，观察治疗前后的X 片变化。

1.4.2 组织光学检查 分别于治疗后第4、8 周每组各处死动物4 只，取骨折间隙组织进行光学检查。

1.4.3 力学性能测试 术后8 周取材。使用Instron 力学测试机(美国Model 8874)对各组修复兔桡骨骨不连的标本进行三点抗弯曲负荷测试。统计分析比较各组时的骨缺损修复性新骨的抗变强度，每组6 例。

2 结果

2.1 X 线结果 A 组:单纯体外冲击波治疗4 周仍未明显愈合，可见清晰的骨折线，骨折断端有大量骨痂形成。8 周时，骨折线模糊，骨痂面积缩小，多形成于骨间膜和两侧骨端，缺损距离缩短。B 组:FG+体外冲击波治疗组4 周骨折线模糊，骨折断端有大量骨痂形成，呈梭型包绕骨不连间隙，缺损区有云雾样阴影。8 周，骨折线模糊，外骨痂完全桥接断端，骨痂面积开始缩小，多形成于骨间膜和两侧骨端，缺损距离缩短。C 组:FG/rhBMP-2/rhbFGF +体外冲击波治疗组4 周时骨折线模糊，呈梭型包绕骨不连间隙，缺损区有云雾样阴影，骨折断端可见少量纤维连接。8 周时未见明显骨折线，骨折端纤维骨痂消失，由板层骨连接，骨塑形明显，但骨纹理较乱。D 组:FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+体外冲击波治疗组4 周时可见骨折线模糊，呈梭型包绕骨不连间隙，缺损区有云雾样阴影，骨折断端可见形成纤维连接，骨小梁明显增多。8 周时骨折线消失，可见连续骨小梁存在并已通过骨折间隙，骨纹理出现较规律的纵向排列，且愈合后塑形好。见图1。

图1 X 线片观察不同组间骨折愈合情况Fig.1 Observations of X-ray for fracture healing between different groups

图2 HE 染色观察不同组间骨折愈合情况Fig.2 Observations of HE staining for fracture healing between different groups

2.2 HE 染色病理结果 从图2 我们可以看出，4周后体外冲击波治疗组，可见骨小梁结构，部分区域有髓腔样结构形成。4 周后FG +体外冲击波治疗组大片软骨形成，软骨细胞增生活跃，周围纤维结缔组织中可见新生血管形成。4 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF+体外冲击波治疗组有散在片状骨小梁结构，骨细胞较多，骨组织较少。4 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+体外冲击波治疗组新生组织为纤维组织结构，成纤维细胞丰富，未见成骨。8 周后体外冲击波治疗组可见成熟骨小梁结构，骨基质丰富，骨细胞缩小，可见造血细胞。8 周后FG +体外冲击波治疗组可见大片软骨化骨现象明显，局部区域骨小梁形成。8 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF +体外冲击波治疗组骨组织成熟度较体外冲击波治疗组稍差，髓腔结构不完整。8 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF/rh-VEGF+体外冲击波治疗组仍以纤维结缔组织为主，中间见少量骨组织。

2.3 生物力学结果 所有测定标本均从桡骨缺损中间部位断裂，断端不整齐。生物力学测定结果发现最大负荷体外冲击波组(88.83 ±2.32)与FG +体外冲击波治疗组(95.67 ±3.83)两组之间并没有差距，无统计学意义(P ＞0.05)。与FG +体外冲击波治疗组相比，FG/rhBMP-2/rhbFGF +体外冲击波治疗组(111.67 ±4.76)生物力学明显，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。与FG/rhBMP-2/rhbFGF+体外冲击波治疗组(126.83 ±5.42)相比，FG/rh-BMP-2/rhbFGF/rhVEGF+体外冲击波治疗差异明显，具有显著性统计学意义(P＜0.01)，说明体外冲击波联合经皮注射增强型纤维蛋白胶负载骨生长因子更能够提高抗弯曲力度。见表1。

表1 生物力学检测结果Tab.1 Results of biomechanical test

3 讨论

对于骨不连的治疗目的，主要在于恢复骨骼的完整性和连续性而发挥其功能。高效、微创、经济、实用的治疗骨不连的方法具有重要意义。根据声学原理和空化效应，选择适当的冲击波能量和冲击量可使骨组织及硬化骨碎裂，形成粉碎性微骨折，有利于骨折愈合［9］。但是单纯体外冲击波治疗4 周仍未明显愈合，可见清晰的骨折线，骨折断端有大量骨痂形成。在8 周时仍然有骨折线模糊、骨痂面积缩小、缺损距离缩短等特点。说明体外冲击波在一定程度上可以有效治疗骨不连，在骨折愈合过程中，不同时期表现的疗效有差异。Gollwitzer［10］通过检测兔皮下注射的四环素、钙黄绿素、茜素红和钙黄绿素蓝等荧光标记混合物的强度，应用兔股骨体外冲击波治疗实验，观察兔股骨骨折2、4、6 周后应用体外冲击波治疗后诱导的新骨形成情况，发现低能量体外冲击波可以明显增强新骨形成超过6 周的时间，尤其是对于骨化的影响在第4 周达到高峰期，随后有所下降。这些研究说明在不同的研究组中，体外冲击波治疗有效，但是成功率不同。结合我们的研究可能说明，不同时期体外冲击波的疗效不同，并且操作的精确性等多种内在或外在因素也会在一定程度上影响体外冲击波治疗骨不连的成功率。

体外冲击波治疗骨不连在临床上已有应用，冲击波能量选择是其尚不能广泛应的重要原因之一。以往所用的能量均是根据冲击波治疗肾结石的经验和估计而来，这对于骨不连的治疗来说是不准确的。能量过低达不到治疗的目的，能量过高则损伤较重［11］。近年有研究发现，BMP、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等因子，它们对细胞增殖与分化及新骨的形成都有诱导和调节作用［12］。而通过我们应用体外冲击波同时应用这些因子发现，从纤维组织结构、成熟骨小梁结构、骨基质以及造血细胞等均可以见明显改善。并且三种因子综合应用比单纯应用一种因子辅助疗效更加显著。骨形成蛋白(BMP)是一种高效的骨诱导性物质，BMP 是一种可与其他材料配合用于修复骨缺损的生物材料，是迄今为止最为肯定的高效的骨生长因子［11，13］。bFGF 能促进软骨细胞前质的分化和软骨细胞的增殖及成熟，特别它是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物中长入，使早期组织中软骨岛数量增多［14］。血管内皮生长因子(VEGF)，亦称血管通透性因子是由正常或肿瘤细胞产生的，分子量为(34～50)×103D 的二聚体蛋白［13］。VEGF 具有强的促血管内皮细胞有丝分裂的作用，增加血管通透性及血管维持功能，它几乎参与了血管形成的全过程，有利于新生毛细血管的生成，为局部材料的降解及新骨的形成创造最佳微环境，还能提高成骨细胞的活性和软骨内成骨，从而促进骨形成，并且血管内皮细胞和成骨细胞之间还存在生长因子分泌和旁分泌的相互关系［15］。在我们的研究中，发现联合应用明显提高骨折的愈合效果。这些疗效增强的原因可能与增强血管通透性、提高骨细胞活性、软骨细胞的增殖等有关，但是具体机制仍然需要更多的研究揭示。

体外冲击波与生长因子联合可以有效治疗骨不连，除其有上述生物学效应外，还表现为增强其机械效应，在一定程度上可以影响到不同密度骨组织之间产生的能量梯度差及扭拉力。我们的实验研究发现，体外冲击波联合经皮注射增强型纤维蛋白胶负载骨生长因子比单纯冲击波更能够提高抗弯曲力度。体外冲击波可以造成骨膜下点状出血，产生微骨折和大量细小的骨碎片并有骨折血肿形成［11］。而多种因子的联合应用可以帮助消除这些效应。这样双重作用从而使处于静止状态的成骨细胞和来自髓腔及邻近软组织的原始成纤维细胞发生聚集和增殖，启动骨愈合。另外，高能冲击波所造成的骨坏死和所产生的大量碎骨片被吸收而释放出大量因子，而这些因子往往仍然不能满足维持骨折愈合过程的因子消耗需要。因此，外源性的这些辅助因子可以增强冲击波治疗效果。还有研究提示，体外冲击波能使骨细胞膜发生扰动和Ras 反应，使细胞膜超极化，从而导致特异性骨相关的转录因子(CBFAI)、Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA 表达，最终形成骨结节［11］，是否这些外源性因子影响到特异性骨相关转录因子等的表达，仍然需要进一步的研究。

另外，已有研究表明BMP 和VEGF 在骨愈合中对成骨有相互依赖及调控的作用，但VEGF 和BMP蛋白在体内半衰期短，直接注入体内易降解，故外源性单纯给予上述蛋白的治疗效果有限，如果将上述蛋白与载体复合在体内达到缓慢持续释放可克服单纯蛋白治疗的缺点。将BMP 与纤维蛋白胶(FG)复合，是因为FG 是一种研究和应用较多的BMP 缓释载体［14］，是BMP 的理想保护剂，能够避免体液对骨生长因子的稀释及降解，对于增强BMP 等的稳定性，延长释放时间具有明确的效果［14］。FG 天然的网状微观结构有助于BMP 的附着和BMP 与靶细胞接触，其强大的黏着力有利于BMP 的缓慢释放。而增强型FG(纤维蛋白胶)能够延缓FG 的降解，使得负载骨生长因子能够长时间释放。因此在增强型纤维蛋白胶基础上复合多种骨生长因子并经皮注射联合冲击波治疗骨不连可能具有重要意义。

动物模型虽然能够较好地模拟人类骨折时的状态，但由于动物机体与人存在一定差异，并且骨折愈合并不是局部过程，因此在动物模型上得到的实验结果还需要进行临床试验［2，15］。另外，由于实验条件、动物数量等多种因素限制，仍然可能存在一些结果的不精确性。总之，本研究通过动物实验初步证明，比单一体外冲击波或因子治疗相比，采用体外冲击波联合经皮注射增强型纤维蛋白胶负载骨生长因子治疗骨不连能够加速骨不连愈合，促进成骨过程，进一步提高骨不连的愈合率。但是，该实验研究与人体生物学的相关性等特点仍然需要更进一步的研究和追溯。

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