B7-1 人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应①

沈 辉 朱玉强 孔 永 王 婧 朱华亭 於葛华 蔡 磊 朱 莹 王志瑶 邱玉华

(苏州大学医学部免疫学系，苏州 215123)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种常见的自身免疫疾病，主要表现为T、B 淋巴细胞功能异常，产生多种自身抗体，形成免疫复合物以及多种组织器官损伤和功能丧失，其中狼疮样肾炎(LN)是SLE 最常见和最严重的并发症，是导致SLE 患者死亡的主要原因之一。T 细胞的过度活化与SLE 的发生发展密切相关，T 细胞活化需要两个不同的信号，第一信号来自于抗原肽-MHC 复合物与T 细胞受体(TCR)的相互作用，第二信号为共刺激信号。B7-1(又称CD80)是APC 表面重要的共刺激分子，其受体为T细胞表面CD28 家族分子，两者结合后可介导T 细胞的活化、增殖与分化［1］，从而引发机体的细胞与体液免疫。

B7-1 抗体可通过竞争结合B7/CD28 信号通路中的B7-1 分子，从而削弱或阻断共刺激信号，降低机体的免疫应答［2］。鼠源性抗体由于其在体内运用易产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)，造成效价降低及引发过敏等后果。采用基因工程将鼠源抗体的可变区与人Ig 恒定区拼接而成的人-鼠嵌合抗体可降低HAMA 反应［3］，延长半衰期。此类抗体一方面具有鼠源抗体Fab 段高亲和力结合抗原的特性，另一方面又具有人源Fc 段介导的ADCC 效应［4］、CDC 效应及免疫调理作用等。本研究在自行成功研制了B7-1 人-鼠嵌合抗体的基础上，旨在运用化学法建立类似人类狼疮样肾炎的小鼠模型［5］，观察抗体对病理损伤的改善作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 6 周龄雌性C57BL/6J 小鼠，体质量25～30 g(苏州大学实验动物中心)，降植烷(2，6，10，14-tetramethylpentadecane，Pristane)(Sigma，美国)，PE-羊抗人IgG(Fc)mAb(R＆D，美国)，Albustix尿蛋白试纸(Bayer，美国)，抗核抗体(ANA)检测试剂盒(北京和杰创新生物医学科技有限公司，中国)，FITC-羊抗鼠IgG 抗体(Jackson，美国)，分泌B7-1 人鼠嵌合抗体的细胞株CHO-ch4E5(本单位建株、保存［6］)。

1.2 方法

1.2.1 B7-1 人鼠嵌合抗体的制备及纯化 取分泌B7-1 人鼠嵌合抗体的细胞株于无血清培养基中，滚瓶培养，待6～7 d 后收集上清，经高速离心和超滤浓缩，采用ProteinG 亲和层析柱分离纯化，Lowry 法定量，过滤除菌，分装于-80℃保存。

1.2.2 B7-1 人鼠嵌合抗体对细胞模型B7-1 分子的识别 将细胞株L929-mock、L929-B7-1 经PBS 洗涤，分别加入B7-1 人鼠嵌合抗体(5 ×105/50 μl)，4℃孵育45 min，充分洗涤后加入PE-羊抗人IgG(Fc)mAb，4℃孵育45 min，充分洗涤后经流式细胞仪分析。

1.2.3 小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定取6 周龄、雌性C57BL/6J 小鼠，予一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml/只。逐月定时检测血清ANA 及尿蛋白水平。待出现异常时取部分小鼠做肾脏HE染色，观察病理学改变。待小鼠出现较高含量的抗核抗体、尿蛋白及较严重的肾脏病理学改变即视为模型建立成功。

1.2.4 蛋白尿含量的测定 以建模日起每月1 次定时测定尿蛋白，采用Albustix 试纸法。依据反应区显色程度判断尿蛋白含量(-):0 mg/L;(±):150～300 mg/L;(+):300 mg/L;(++):1 000 mg/L;(+++):3 000 mg/L;(++++):＞20 000 mg/L。

1.2.5 血清ANA 抗体水平的测定 每月定时采集血清，经免疫荧光法进行定量。具体操作按ANA 检测试剂盒说明书进行。血清稀释后，在HEP 细胞片反应区室温孵育30 min，设阴、阳性对照。经洗涤后再与FITC-羊抗鼠抗体避光室温孵育30 min，经洗涤，封片置于荧光显微镜下观察。结果判定:(-):无荧光;(+):荧光强度很弱;(++):荧光中等亮度;(+++):荧光强度较强;(++++):与阳性对照同等亮度。

1.2.6 肾脏病理学改变的观察 取尿蛋白及ANA水平出现异常的部分小鼠，取肾脏经10%福尔马林固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片及HE 染色。置于光学显微镜下观察肾脏的病理学改变。同时分析其与尿蛋白及ANA 水平的相关性。

1.2.7 抗体对小鼠疾病模型的免疫干预 取模型鼠随机分为3 组，每组5 只。抗体干预组:于实验的第1、3、5、8、15、43、71、99 天分别经眼眶静脉注射抗体，200 μg/只［7］;模型组:给予等剂量的人同型IgG;阳性对照组:于第1、3、5、8、15 天注射免疫抑制剂CTX，2.5 mg/只。同上法分析尿蛋白及ANA 水平的动态变化。

1.2.8 小鼠肾脏免疫复合物(IC)的检测 注射抗体3 个月后，处死小鼠，取一侧肾脏经福尔马林固定，乙醇脱水，石蜡包埋后切片，与FITC-羊抗鼠IgG避光孵育30 min，洗涤封片后，置于荧光显微镜下观察IC 的沉积。

1.2.9 透射电镜对肾小球内沉积物及基底膜改变的观察 取另一侧肾脏，切成1 mm ×1 mm ×1 mm小块，经固定、脱水、包埋、切片、染色后用透射电镜观察。

1.3 统计学分析 采用SAS9.0 软件对数据进行统计学分析。对等级资料进行Spearman 等级相关分析;对计数资料采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 B7-1 人鼠嵌合抗体对膜型B7-1 分子的识别间接免疫荧光法经流式细胞术分析显示，B7-1 人鼠嵌合抗体与细胞株L929-mock、L929-B7-1 的阳性结合率分别为0.798%、95.1%(图1)。

2.2 小鼠模型的建立及生物学鉴定 用Pristane诱导2 个月时，部分小鼠出现尿蛋白和ANA，随时间延长，尿蛋白含量和血清ANA 荧光强度增强，4个月时，尿蛋白含量为+～+++，ANA 为++～+++(表1)。此时肾小球的体积增大，炎性细胞侵润增多(图2)。提示此时小鼠狼疮样肾炎模型建立成功。结果可见尿蛋白及ANA 水平与肾脏病理学改变的严重程度相关，尿蛋白及ANA 均达到++及以上者视为可用于抗体干预的模型小鼠。尿蛋白及ANA 水平均在++及以上者占建模鼠总量的80%。

2.3 小鼠蛋白尿检测 干预后逐月检测，抗体干预组尿蛋白阳性率及含量逐渐减小，干预3 个月时，蛋白含量为±～++，而模型组尿蛋白有上升趋势，3个月时，尿蛋白含量为++～++++，此时干预组和造模组尿蛋白出现的频率和程度经检验比较，有明显差异(表2)(P＜0.01)。

图1 B7-1 人鼠嵌合抗体对膜型B7-1 分子的识别Fig.1 B7-1 chimeric antibodies recognizing membrane molecule B7-1

2.4 血清中抗ANA 抗体的表达 干预后，抗体干预组ANA 荧光强度有所减弱，模型组荧光反而变强，3 个月时，抗体干预组和模型组荧光强度分别为+～++，+++～++++(见表3)。由图3 可见，3 个月时模型组核型可见斑点型、核仁型和均质型，荧光强度很强，抗体干预组荧光很弱。提示嵌合抗体对模型小鼠血清抗核抗体的抑制作用。

2.5 肾脏组织的病理学改变 干预第3 个月时肾脏病理切片H＆E 染色光学显微镜下观察，造模组肾小球体积中重度增大，细胞数量增多，内皮细胞及系膜基质增生，且可见肾小球炎性细胞侵润，部分肾小管上皮样细胞可见水肿样变性、血管充血明显，纤维组织增生。抗体干预组肾小球体积轻中度增大，细胞数轻度增多，肾小管轻度充血，少许淋巴细胞侵润。两组比较，干预组肾脏病理学改变轻于造模组。阴性对照组肾脏组织无明显病理学改变(图4)。

表1 注射Pristane 后小鼠尿蛋白及ANA 动态变化Tab.1 Dynamic changes of mice urinary protein and ANA after injection Pristane

表2 干预后小鼠尿蛋白动态变化(n=5)Tab.2 Dynamic changes of mice urinary protein after intervention(n=5)

表3 干预后小鼠血清ANA 荧光强度变化(n=5)Tab.3 Fluorescence intensity change of mice in serum ANA after intervention(n=5)

2.6 肾脏组织免疫复合物荧光染色观察 肾脏组织石蜡切片经FITC 羊抗鼠IgG 免疫荧光染色，置于荧光显微镜下观察:造模组可见较强的荧光强度，免疫荧光衬托出明显的肾小球轮廓，免疫复合物沉积于肾小球系膜毛细血管襻。抗体干预组肾小球免疫复合物产生的荧光范围较小，荧光强度较弱，肾小球轮廓较明显，提示干预组肾小球上的IC 明显少于造模组。阴性对照组肾小球未见荧光(图5)。

2.7 透射电镜对肾小球沉积物及基底膜改变的观察 干预至3 个月时在电子显微镜下可见造模组肾小球基底膜和内皮细胞间有大量的电子致密物沉积，足细胞间突起广泛融合，足突消失，沉积物在基底膜表面呈驼峰状，基底膜增厚，提示免疫复合物在肾小球上沉积;与造模组相比，抗体干预组肾小球内皮细胞间有少量电子致密物沉积，可见正常足突，基底膜厚度较均匀(图6)。

图2 注射Pristane 后小鼠肾脏H＆E 染色(×400)Fig.2 Mice kidney of stained with H＆E after injection Pristane(×400)

图3 干预3 个月时C57BL/J6 小鼠血清ANA 表达(×600)Fig.3 Expressing of ANA in C57BL/J6 mice serum 3 months after intervention(×600)

图4 干预3 个月时C57BL/J6 小鼠肾脏H＆E 染色(×400)Fig.4 C57BL/J6 mice kidney of stained with H＆E 3 months after intervention(×400)

图5 干预3 个月时C57BL/J6 小鼠肾脏IC 沉积情况(×400)Fig.5 Deposition of IC on kidneys of C57BL/J6 mice 3 months after intervention(×400)

图6 干预3 个月时肾脏组织超微结构改变的透射电镜分析Fig.6 TEM analysis of kidney tissue ultrastructural changes 3 months after intervention

3 讨论

机体正常免疫应答过程中，B7 分子是激发有效的T 淋巴细胞免疫反应所必需的协同刺激分子［7］，B7 分子的配体是表达在T 细胞表面的CD28 及CTLA-4，其中B7 与CD28 的结合，提供转导T 淋巴细胞活化的协同共刺激信号，进而促进特异性T 淋巴细胞增殖。已有研究表明，B7/CD28 信号通路的过度活化与自身免疫性疾病的发生发展密切相关，若缺乏B7/CD28 共刺激信号，将导致T 细胞的无能或者免疫耐受［8］。这显示通过阻断这一通路诱导特异性免疫耐受，可能达到对自身免疫性疾病的治疗作用。

运用B7 单克隆抗体特异性阻断B7/CD28 信号通路来抑制机体免疫应答，鼠源性单克隆抗体由于免疫原性高，易引起人鼠抗体反应(Human antimouse antibody，HAMA)，限制了其应用。采用基因工程设计出的嵌合抗体(Chimeric antibody)是一种人源化的重组抗体，它是应用DNA 重组技术将鼠源性的单克隆抗体V 区基因与人免疫球蛋白的C 区基因相连接，构建成嵌合基因，插入适当质粒，转染相应宿主细胞表达产生的。此类抗体的优点是一方面可发挥鼠源性抗体Fab 段高亲和力结合抗原的特性;另一方面，可通过人IgFc 段介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(Complement dependent cytotoxicity，CDC)［9］及免疫调理作用等。

通过建立动物疾病模型模拟人类疾病的发生发展过程及临床表现是研究疾病的发生、发展、转归及寻找新的诊治途径的重要手段。近年来，运用降植烷诱导的小鼠狼疮样模型已成为诱导性SLE 模型最常用的方法［10］，这种诱导SLE 样综合症的方法较天然成模鼠有几方面优势:Pristane 诱导的小鼠狼疮样肾炎在免疫学、组织学和病理学等方面与人类狼疮肾炎疾病很类似，有良好的相关性。发病迅速，且小鼠来源方便，易于大量繁殖，成本低于天然成模鼠。

本研究中造模组一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml/只，每月定期检测小鼠的尿蛋白、ANA 及肾脏病理学改变。诱导4 个月时，小鼠出现高浓度的ANA和尿蛋白，且肾脏出现较严重的形态学改变。提示小鼠尿蛋白和ANA 的产生与肾脏形态学改变是一致的。取尿蛋白含量达到++，ANA 荧光强度达到++的小鼠随机分为3 组，抗体干预组依次注射B7-1 人-鼠嵌合抗体。尿蛋白作为肾脏受累的主要标志，在干预后，抗体干预组尿蛋白的含量逐渐降低，由++～+++降为±～++，而模型组尿蛋白测定结果反而升高，两组比较有明显差异(P＜0.01)。在SLE 患者血清中95%以上都出现抗ANA抗体［11］，研究后期显示抗体干预组中抗ANA 抗体的荧光强度和滴度要明显低于模型组。

干预3 个月时肾脏组织病理学观察，造模组肾脏病理学切片肾小球周围淋巴细胞侵润，肾小球体积中-重度增大，细胞数量增多，上皮细胞可见水肿样变性，血管充血明显，纤维组织增生。干预组肾小球体积轻度增大，上皮细胞水肿程度以及血管充血程度均明显轻于造模组。免疫复合物荧光染色比较，造模组小鼠肾小球部位IC 沉积明显，荧光强度强，可衬托出肾小球轮廓，而干预组荧光范围小，强度弱。肾脏透射电镜超微结构分析造模组肾小球内皮细胞下有大块电子致密物，足细胞融合，基底膜增厚，干预组内皮细胞间有少量电子致密物沉积，基底膜厚度较均匀。上述肾脏病理学分析均显示干预组肾脏的病理损伤要明显轻于造模组。

CTX(又称环磷酰胺)是一种烷化剂，主要用于肿瘤免疫治疗，可促进癌细胞的凋亡。近年来证实它也具有显著的免疫抑制作用，可用于多种常见的自身免疫疾病的治疗［12］。本实验用其作为阳性对照，观察以上指标可以看出B7-1 人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的干预效果要比CTX 阳性对照组强，提示CTX 是一种非特异性免疫抑制剂，不能准确进攻靶细胞，干预效果大大降低，并且有报道证实CTX 在体内会引起骨髓抑制、肝脏损害、出血性膀胱炎等多种副作用及不良反应。

实验证明，B7-1 人-鼠嵌合抗体在小鼠体内通过阻断B7-1/CD28 通路降低了机体免疫细胞的活化，减轻了狼疮样肾炎的病理学损伤，对于模型的建立具有逆转作用，对肾炎的病变具有治疗作用。目前，通过阻断B7/CD28 共刺激信号通路来减轻机体自身免疫反应已成为治疗SLE 的新方向，而人源化的嵌合抗体具有免疫源性低，特异性强，体内半衰期延长等特点，对于将来进入临床应用，减少用药量，降低患者的副作用等具有良好的应用前景。

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