远程缺血后适应中大鼠海马CA1 区TLR4 和IL-6 的表达变化及其意义

张 江 常莉莎 王大力 周 涛 刘会英 (华北理工大学附属医院神经内科二病区，唐山 063000)

远程缺血后适应是指器官缺血后，对远隔器官进行短暂的轻度的缺血再通，可起到保护作用［1］。研究表明肢端缺血可以减少海马CA1 区的延迟神经元损伤［2］。但其机制尚不清楚。ILR4 为人体固有免疫的触发因子［3］，参与介导对抗病原体的一系列炎症反应，诱导促炎性细胞因子IL-6 等的释放。鉴于上述过程是缺血再灌注损伤的重要机制之一［4］，本实验在此基础上，探讨了远程缺血后适应的脑保护作用与TLR4 和IL-6 表达的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备 72 只健康雄性SD 大鼠［自北京华阜康生物科技股份有限公司购买，实验动物使用许可证编号:SCXK(京)2009-2004］，体重250～300 g，随机分为假手术组(S 组)、对照组(C 组)、远程缺血后适应组(P 组)，各组分为12、48、24、72 h 共4 个时间点组，每组6 只大鼠。应用改进的Longa［5］法，建立右侧脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，小心分离右侧颈总动脉和颈外动脉，线栓由颈总动脉进入颈内动脉至大脑中动脉，线栓头端距血管分叉处约18 mm。2 h 后再次麻醉大鼠，C 组直接拔除线栓;P 组在拔除线栓后即刻用止血带扎紧双侧后肢根部，扎紧/松开各10 min 循环3 次，此为RIP。假手术组只分离出各动脉，不置入线栓。以大鼠麻醉清醒后出现对侧肢体瘫痪为标准。参照Zea Longa［5］的5 分制评分标准，剔除评分为0 分和4 分的大鼠，保证各小组6 只不变。

1.2 HE 染色及免疫组化染色 分别于各时间点将大鼠深度麻醉后，用4%多聚甲醛溶液行心脏灌流，断头取脑后行外固定。鼠脑做约2 mm 冠状切片，常规石蜡包埋，制成厚约4 μm 的切片，取海马最大的冠面切片用于HE 染色和免疫组化染色。

1.2.1 HE 染色 依照常规方法脱蜡、染色、脱水、透明、封片后，光镜下观察。

1.2.2 免疫组化染色 TLR4 和IL-6 抗体均为兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗体(由北京博奥森生物有限公司)，稀释度均为1∶200;PV6001 试剂盒购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。应用常规PV法:脱蜡至去离子水，枸橼酸修复缓冲液行抗原高压热修复，自然冷却至室温，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10 min，PBS 缓冲液洗涤3 min ×3 次，滴加特异性抗体，4℃孵育过夜，PBS 缓冲液洗涤3 min×3 次，PV6001 试剂盒中的试剂(抗兔抗体酶复合物)37℃孵育30 min，再次PBS 缓冲液洗涤3 min×3 次，DAB 镜检控制显色，流水冲洗3 h 以上去除DAB 残留物，苏木素复染，脱水、透明封片。光镜下观察。用PBS 代替一抗作阴性对照，以胞浆为棕黄色为阳性。每只大鼠取连续4 张相同部位的切片，每张切片在200 倍光镜下随机取海马CA1 区的6 个不同视野，通过Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统统计每个视野的免疫组化阳性细胞数，取其平均数为该大鼠阳性细胞的表达数量。

1.2.3 Western blot 法检测 TLR4 蛋白取脑组织标本与RIPA(用前加入PMSF 至终浓度为1 mol/L)组织裂解液按约1∶3的比例混合捣碎冰上裂解40 min，40℃离心15 min，取上清-20℃保存。BCA 蛋白浓度测定。

图1 三组大鼠海马CA1 区HE 染色结果(×200)Fig.1 Three groups of CA1 region of hippocampus in rats with HE staining(×200)

1.3 统计学分析 数据均采用SPSS17.0 统计软件进行分析，计量资料用±s 表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马CA1 区HE 染色结果 S 组大鼠海马结构清晰，CA1 区细胞形态正常，排列整齐，胞质染色均匀，胞核颜色正常，圆形或椭圆形，核仁明显，核膜清晰(图1A)。C 组大鼠海马结构松散，CA1 区细胞稀疏，神经元明显减少，可见较多的神经元胞体缩小，胞浆浓缩深染，胞核固缩，核仁核膜消失;也有的神经元肿胀淡染，呈三角形或者梭形;有的胞浆出现大片空泡区，提示脑水肿严重;有些区域出现小片坏死，细胞核碎裂甚至溶解消失(图1B)。P 组大鼠海马结构欠完整，但较C 组神经元缺失减少，胞体缩小深染现象明显改善，神经元肿胀减轻(图1C)。

2.2 各组大鼠海马CA1 区免疫组化染色结果

2.2.1 TLR4 染色结果 在海马CA1 区，S 组各时间点TLR4 表达水平均低。C 组与P 组TLR4 表达较S 组明显增高(P＜0.05)。在C 组，TLR4 12 h 开始表达，24 h 达到高峰，72 h 开始下降。P 组TLR4阳性表达在72 h 前均低于C 组(P＜0.05)，而72 h时略高于C 组，但无统计学意义(P ＞0.05)。实验结果提示缺血再灌注时，大鼠海马CA1 区TLR4 被激活，但远程缺血后适应使TLR4 的激活受到抑制而延迟。见表1，图2。

表1 各组大鼠海马CA1 区TLR4 阳性细胞表达数比较(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

表1 各组大鼠海马CA1 区TLR4 阳性细胞表达数比较(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

Note:The observation time n=6;Compared with the sham group，1)P＜0.05;Compared with the control group，2)P＜0.05.

图2 三组大鼠海马CA1 区TLR4 表达结果(×200)Fig.2 Result of TLR4 expression in three group of rat hippocampal CA1 region(×200)

表2 各组大鼠海马CA1 区IL-6 阳性细胞表达数比较(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

表2 各组大鼠海马CA1 区IL-6 阳性细胞表达数比较(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

Note:The observation time n=6;Compared with sham group，1)P＜0.05;Compared with the control group，2)P＜0.05.

表3 I/R 组和RPC 组大鼠海马区TLR4 蛋白表达的相对吸光度比较(n=6，±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6，±s)

表3 I/R 组和RPC 组大鼠海马区TLR4 蛋白表达的相对吸光度比较(n=6，±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6，±s)

Note:Compared with the control group，1)P＜0.05.

2.2.2 IL-6 染色结果 在海马CA1 区，S 组各时间点IL-6 仅有少量表达。C 组与P 组有明显的IL-6 表达，与S 组相比均有统计学意义(P＜0.05)。IL-6 在C 组12 h 开始表达，48 h 达到高峰，72 h 开始下降。P 组IL-6 阳性细胞表达在各时间点均低于C 组，有显著统计学意义(P＜0.05)。实验结果提示缺血再灌注时，大鼠海马CA1 区的IL-6 被激活，但远程缺血后适应使IL-6 的激活受到抑制。见件表2，图3、4。

2.2.3 Western blot 定量检测TLR4 表达结果Western blot 扫描图片结果显示:I/R 组和RPC 组TLR4 蛋白表达各时间点较Sham 组明显增强。均在24 h 达高峰，48 h 后呈下降趋势。RPC 组各时间点TLR4 蛋白表达较I/R 组减少，比较有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

3 讨论

缺血再灌注所致的脑损伤，已被证明是影响关于血管再生预后的重要因素［6］，许多研究者都致力于寻找新的药物和方法来保护脑组织免受缺血再灌注损伤。早在50 多年前，Sewell［7］及其同事就曾报道，间歇的再灌注(相当于目前的缺血后处理)，可以废除心室颤动。直到2003 年Zhao 等［8］人提出“缺血后适应”这一假说后，缺血后适应的概念引起越来越多的重视。而如今，经典的缺血后适应已经延伸包括药理学后适应和远程缺血后适应。最早发现可以实施远程缺血后适应的器官为肾脏，由Kerendi 等［2］通过短暂夹闭小鼠肾动脉而实现对小鼠缺血心肌的保护作用。接着肢体远程缺血后适应的心肌保护作用也得到证实［9］。在脑缺血的研究中，也已有研究提示肢体的缺血后适应具有神经保护作用［10］。

图4 各组不同时间点海马TLR4 免疫印迹Fig.4 Each group at different time points in hippocampal TLR4 blotting

对于远程缺血后适应的机制少有报道，目前普遍认为远程缺血后适应的脑保护作用在于通过肢端、肾脏等短暂的缺血再灌注使心脏或脑产生对随后而来的较严重缺血再灌注损伤的耐受能力，而缺血再灌注损伤的重要机制之一为免疫炎症反应，TLR4 则是免疫炎症反应的重要环节，内源性配体与TLR4 结合后发生结构改变，并募集髓样分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88，MyD88)等转接蛋白，通过MyD88 依赖或非依赖性信号转导通路激活转录因子NF-κB 和干扰素相关蛋白(Interferon binding protein，IRFs)，进而诱导产生TNF-α，IL-1 和IFN-γ 等一系列炎症细胞因子［11］。已有实验证明，在树鼩血栓性脑缺血的模型中，缺血后适应4 h 及24 hTLR4 蛋白表达减少，提示缺血后适应可能与调控TLR4 表达有关［12］。

本研究实验结果显示，大鼠脑缺血再灌注后12 h时TLR4 和IL-6 的表达已经开始增高，提示缺血再灌注损伤炎症反应在12 h 已经启动，TLR4 和IL-6 表达分别于24、48 h 达到高峰，与对照组相比，远程缺血后适应组TLR4 表达在12、24、48 h 均受抑制，提示远程缺血后适应的脑保护作用与抑制TLR4表达有关，而在72 h 表达水平与对照组相当，可能与脑缺血后期脑组织的自身修复有关。IL-6 在远程缺血后适应中的表达于各时间点都低于对照组，提示其激活在远程缺血后适应中受到抑制。

通过本实验可以推断远程缺血后适应可以通过抑制TLR4、IL-6 相关的炎症反应实现脑保护作用，为进一步明确远程缺血后适应的分子机制以及临床应用提供了依据。

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