C57BL／6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触数量变化的观察△

李晓瑞蒋兴旺张延平

·实验研究·

C57BL／6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触数量变化的观察△

李晓瑞1，2蒋兴旺1张延平1

目的 探讨C57BL／6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触（ribbon synapses，RS）的数量变化情况。方法 分别取2、6、10、12月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜（每组5只），应用免疫组织化学染色方法对RS前、后膜进行双重标记，激光共聚焦显微镜下定位成像，并应用三维重建技术对基底膜各段RS的数量进行计数。结果与2月龄小鼠相比较，6月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜RS数量减少主要发生在底回，10月龄时各回RS数量均明显减少，12月龄时顶回、中回RS数量继续减少，底回反而有少许增多。结论 RS数量减少可能发生在C57BL／6J小鼠老年性聋的早期阶段，探索阻止RS数量减少的治疗措施可能成为早期干预老年性聋的重要途径。

C57BL／6J小鼠； 内毛细胞； 带状突触

C57BL／6J小鼠是一种具有先天性遗传缺陷的老化型小鼠，其随年龄增长的听力学改变与临床上老年性聋的表现相似，已成为目前研究老年性聋较为成熟的动物模型［1］。耳蜗内毛细胞带状突触是声信息传递到中枢的第一个传入性的突触结构，因其空间分布呈带状，故被称为“带状突触”（ribbon synapses，RS），在声音的编码和传导过程中起着十分重要的作用［2］。现有研究表明，各种因素如衰老、噪声持续刺激、基因突变、耳毒性药物等都会影响RS的形态结构和数量，引起不同程度的感音神经性听力损失［3～5］。既往研究多利用超薄切片技术通过透射电镜来观察带状突触的形态结构，为了进一步观察年龄增长过程中带状突触数量的动态变化，本研究联合应用免疫荧光染色技术、激光共聚焦显微镜成像及三维重建技术，观察C57BL／6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触数量的变化，为今后老年性聋发病机制的研究和预防提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 分别选取2、6、10、12月龄C57B L／6J小鼠（由北京大学医学部动物实验中心提供）各5只，雌雄不限，体重20～30 g，耳廓反射正常，均排除了中耳及内耳疾病。

1.2 实验试剂 1%戊巴比妥钠（解放军309医院动物研究中心提供）；山羊抗小鼠CtBp2抗体（美国SANTA CRUZ公司）；兔抗小鼠谷氨酸受体2／3抗体（美国CHEMICON公司）；FITC标记驴抗山羊抗体（美国Jackson公司）；TRITC标记驴抗兔二抗（美国Jackson公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 耳蜗基底膜制备 以1%戊巴比妥钠按40 mg／kg行腹腔内注射麻醉小鼠后，将其固定于手术台上，打开胸腔，细针穿刺心尖并以动脉血管夹固定，先用0.01 M PBS灌注置换血液，直至灌注液转为无色，然后用4%多聚甲醛进行心脏灌注，固定标本。迅速断头去掉颞骨，取出双侧耳蜗，置于解剖显微镜下去除镫骨，开放圆窗及卵圆窗，并用细针在蜗尖钻孔，使顶回与底回之间形成通路，再用4%多聚甲醛缓冲液经直径2 mm的塑料吸管缓缓自蜗尖向圆窗及卵圆窗进行灌流，置换出前庭阶及骨阶内的外淋巴，充分固定耳蜗内的组织和细胞。将完成灌注的耳蜗放置于4%多聚甲醛缓冲液中，室温固定1.5小时或放置于4℃冰箱过夜。固定完成后取出耳蜗，置于0.01 M PBS中漂洗2次，再置于10% EDTA（p H＝7.4）液中浸泡1天进行脱钙，直至细针能轻松穿刺入骨壁。将脱钙满意的耳蜗放置于0.01 M PBS中，解剖显微镜下从底回剥除蜗壳，去除耳蜗骨壁、血管纹、螺旋韧带等，全层剥离至顶回，依次将各回基底膜从蜗轴上完整分离下来，清除前庭膜及盖膜，以蜗尖与前庭窗之间的连线将基底膜分成底、中、顶三段（本实验动物的实验方法得到解放军309医院动物饲养中心和使用委员会批准）。

1.3.2 免疫荧光双标记染色 将分离好的基底膜置于含0.25%Triton X-100中孵育30 min；一次性塑料吸管吸除PBST液，用PBS缓冲液将基底膜冲洗3次，10分钟／次；冲洗后的基底膜放置于含3%驴血清封闭液的EP管中30 min，用以阻断非特异性位点；吸除封闭液，再用PBS缓冲液将基底膜冲洗3次，10分钟／次；将分离出的基底膜置于山羊抗鼠CtBp2抗体（1：100，PBS溶液稀释）、兔抗鼠Glu R2／3抗体（1：100，PBS溶液稀释）的一抗混合液中，放入4℃冰箱过夜；第二天，取出标本，将经一抗染色的基底膜置于PBS缓冲液冲洗3次，10分钟／次；分别加入驴抗羊FITC（1：100，PBS溶液稀释）、驴抗兔Ig G-TRITC（1：100，PBS溶液稀释）抗体，室温环境下避光染色30 min；吸除二抗，用PBS缓冲液冲洗3次，10分钟／次，蒸馏水冲洗1次；解剖显微镜下将标本平铺于滴有DAPI的载玻片上，封片。

1.3.3 激光共聚焦显微镜成像 将免疫荧光染色后的标本放置于激光共聚焦显微镜下，用波长358 nm的激光激发DAPI，40倍油浸物镜下选定观察位点，并局部数字放大1.5倍，首先定位内毛细胞核，然后用波长494 nm的激光激发FITC、547 nm的激光激发TRITC，适当调节视图窗口大小，采用双通道观察模式，双标记后的色对呈橙黄色。当特异性荧光出现时，以1.0μm的层距对基底膜行连续断层扫描，直至特异荧光点消失为止，采集二维图像，每一组序列图像文件放置于一个文件夹内，并按序号排列。

1.3.4 三维建模 在3DS max2012中的顶视窗口中按序列扫描时由上至下的顺序调入采集的二维图像做为视口背景，先调入第一幅二维图像，在出现橙色荧光的位置画球体做为标记，再调入下一幅。如果出现橙色荧光的位置与上一幅相同，不做标记，认为是同一个突触，如果在其他位置上出现橙色荧光，则表示在这一层面上有新的突触出现，再用球体做出标记［6］。以此类推，最后计算出每条基底膜各段RS的总数及平均每个内毛细胞RS的数量。每个内毛细胞的RS的平均数量为每组基底膜各段每视野中每个内毛细胞RS的平均数量之和的均数，以均数±标准差表示。

1.4 统计学处理 运用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，同一月龄段小鼠耳蜗基底膜不同部位RS总数、不同月龄段小鼠耳蜗基底膜同一部位RS总数以及同一月龄段小鼠耳蜗基底膜不同部位平均每个内毛细胞RS数量和不同月龄段小鼠耳蜗基底膜同一部位平均每个内毛细胞RS数量的比较采用单因素方差分析，两两比较使用Tukey’s-b检验；不同月龄段小鼠不同部位RS总数以及不同月龄段小鼠不同部位平均每个内毛细胞RS数量采用可重复测量双因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜各段RS总数比较 与2月龄比较，6月龄时小鼠耳蜗基底膜上RS的数量减少主要发生在底回，中回有少量减少，顶回无变化；10月龄时RS数量在顶回开始减少，中回继续减少，底回数量维持不变；12月龄时其数量在顶回、中回继续减少，底回数量反而有少许增多（表1，图1）。

表1 不同月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜各回RS总量（个，±s）

表1 不同月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜各回RS总量（个，±s）

注：*与同月龄中、底回RS比较P＜0.05；△6月龄和10月龄段小鼠耳蜗基底膜顶、中、底回RS总数两两比较均为P＜0.05；**与同月龄底回比较，P＜0.05；△△两两比较在顶回，除2月与6月龄比较P＞0.05外，其余各月龄比较P＜0.05；在中回，2月龄与6、10、12月龄，6月龄与10、12月龄比较，P＜0.05；在底回，2月龄与6、10、12月龄比较，P＜0.05

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可见，不同月龄及基底膜不同部位对C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜RS总数影响不同，年龄及基底膜不同部位两因素对基底膜RS总数的影响存在交互作用，即不同年龄、基底膜不同部位RS总数不同。

2.2 C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜各段每个内毛细胞RS平均数量比较 不同月龄小鼠耳蜗基底膜各段平均每个内毛细胞RS数量与耳蜗基底膜各段RS总数结果基本一致（表2）。

表2 不同月龄C57BL／6J小鼠基底膜不同部位每个内毛细胞RS的数量（个，±s）

表2 不同月龄C57BL／6J小鼠基底膜不同部位每个内毛细胞RS的数量（个，±s）

注：*与同月龄中、底回比较P＜0.05；△6月龄和10月龄小鼠耳蜗基底膜顶回、中回、底回上每个内毛细胞RS数量两两比较均为P＜0.05；△△两两比较在顶回，除2月与6月龄外，其余各月龄比较P＜0.05；在中回，2月龄和6、10、12月龄，6月龄和10、12月龄比较，P＜0.05；在底回，2月龄和6、10、12月龄比较，P＜0.05

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图1 不同月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜不同部位RS免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下的三通道合成图像

可见，不同月龄及基底膜不同部位对C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜上平均每个内毛细胞RS数量的影响不同，并且，年龄因素和基底膜不同部位两因素之间对每个内毛细胞RS平均数量的影响存在交互作用，即不同年龄、基底膜不同部位平均每个内毛细胞RS数量不同。

3 讨论

耳蜗内毛细胞传入神经突触是声音信息传递到中枢神经系统的第一个传入性的突触结构，是声音信号传导和释放的重要节点，在听觉形成和听力损伤过程中起着不可替代的作用，各种因素导致带状突触形态结构、数量及功能发生改变后，都会引起不同程度的听力损失。

研究发现，在成熟的RS中可检测到20余种蛋白成分，其中RIBEYE是目前已知的带状突触前膜上唯一的特异性蛋白成分，可能具有酶活性［7］。RIBEYE含有A区和B区，其中B区包含除了20个N末端氨基酸以外的C末端结合蛋白2（CtBP2）的全部序列，抗CtBP2的抗体可以与RIBEYE的B区结合，达到标记突触前膜的目的。另外，由于内毛细胞与传入神经纤维突触间通过谷氨酸受体（glutamate receptor，GluR）介导快速神经传导，而Glu R2、Glu R3属于а-氨基羟甲基恶唑丙酸（amino-hydroxy-methyloxazole propionic acid，AMPA）受体类型，位于突触后神经末梢膜递质受体斑上，因此，应用抗Glut2／3抗体与GluR2、Glu R3结合，能够标记突触后膜。本实验中选取2、6、10、12月龄的具有先天性遗传缺陷的C57BL／6J小鼠为实验对象，通过免疫荧光双标记的方法对耳蜗基底膜的带状突触前、后膜标进行记，采用激光共聚焦显微镜对突触的每一层面进行双通道扫描，同时出现红色和绿色荧光的位点（双通道合成后的图像为橙黄色）定位一个完整的RS，可以较为简便地标记耳蜗基底膜上RS的数量。

本实验结果显示，与2月龄比较，6月龄时耳蜗基底膜上RS的数量减少主要发生在底回，中回有少量减少，顶回无变化；10月龄时RS数量在顶回开始减少，中回继续减少，底回减少维持不变；12月龄时其数量在顶回、中回继续减少，底回数量反而有所增多。而既往研究发现，C57BL／6J小鼠随着月龄增大，在6～8月龄时开始出现听力下降，ABR反应阈显示以高频听力下降为主［8，9］，这种结构和功能变化的一致性，提示RS数量减少可能与C57BL／6J小鼠听力损失密切相关。根据Stamataki等［10］的研究，老年小鼠的RS数量较正常青年小鼠明显减少，其数量几乎下降至年轻小鼠的一半，从蜗轴方向或从内毛细胞底部观察发现，年轻动物传入神经末梢放射状分布呈均一性，而老年动物高频分布区域出现选择性缺失。因此推测，在C57BL／6J小鼠年龄增长的过程中，可能由于毛细胞静纤毛的顶连接结构发生异常［11，12］，破坏了细胞顶部的机电转换装置，导致声信号在诱导内毛细胞发生膜电位变化时其幅度明显增大，其结果使突触前膜释放大量的谷氨酸，产生神经毒性作用，诱导传入神经细胞发生水肿、变性，甚至坏死等突触兴奋性损伤，这种损伤长时间积累导致带状突触数量和结构的改变，最终影响听觉功能［13］。

本研究还发现，C57BL／6J小鼠6月龄时耳蜗基底膜底回RS数量减少最显著，而此时顶回及中回的突触数量尚无明显变化，说明RS的数量首先从底回开始减少。Stamataki等［10］也发现C57BL／6J小鼠内毛细胞传入神经突触的数量在基底膜不同区域分布不同，老年小鼠耳蜗基底膜底回内毛细胞表面的RS不成比例缺失，而顶回RS相对保留较多；同时老年小鼠底回残存的RS体积增大，神经末梢内线粒体体积也明显大于年轻动物，但是突触的囊泡数量减少，这些亚细胞结构的改变可能会直接降低胞吐效率。因此，根据基底膜底回带状突触形态和数量的变化，推测C57BL／6J小鼠基底膜高频区域RS比低频区域更易受到不良因素的影响而发生缺失，这与老年性聋患者的听力首先从高频区开始下降相一致。另外，文中结果显示C57BL／6J小鼠在10月龄和12月龄时耳蜗基底膜RS数量又出现缓慢增加的现象，其原因可能与某种代偿机制有关，机体可能存在以增加突触数量来代偿听力损失的机制，可能与带状突触在数量上的可塑性有关［14］，有待于扩大研究小鼠的月龄范围进一步探讨。

研究提示C57BL／6J小鼠耳蜗内毛细胞RS数量减少可能发生在老年性聋的早期阶段，针对RS数量减少采取有效治疗措施可能为早期干预老年性聋提供重要实验依据。但是由于实验条件的限制，本研究仅止步于12月龄C57BL／6J小鼠，缺乏对同系更年长的小鼠及其它鼠系的进一步比较研究，同时在老年性聋发生发展的过程中，RS的形态、功能及数量的变化是一个十分复杂的过程，其具体机制还需长期和深入的探索。另外，由于多重免疫荧光标记的局限性，只能对RS数量进行计数，无法观察单个突触的形态和其亚细胞结构的变化，有待于今后利用电镜技术进一步研究。

1 Francis HW，Rivas A，Lehar M，et al.Two types of afferentterminals innervate cochlear inner hair cells in C57BL／6J mice［J］.Brain Res，2004，1016：182.

2 李姝娜，姜学钧，柳柯，等.内毛细胞带状突触的形态及功能研究进展［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43：391.

3 Khimich D，Nouvian R，Pujol R，et al.Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling［J］.Nature，2005，434：889.

4 Jing Z，Rutherford MA，Takago H，et al.Disruption of the presynaptic cytomatrix protein bassoon degrades ribbon anchorage，multiquantal release，and sound encoding at the hair cell afferent synapse［J］.Neurosci，2013，33：4456.

5 Singer W，Zuccotti A，Jaumann M，et al.Noise-induced inner hair cell ribbon loss disturbs central arcobilization：a novel molecular paradigm for understanding tinnitus［J］.Moleurobiol，2013，47：261.

6 李姝娜，柳柯，高建，等.三维建模方法分析耳蜗内毛细胞带状突触数量［J］.中国医科大学学报，2008，5：580.

7 Zenisek D，Davila V，Wan L，et al.Imaging calcium entry sites and ribbon structures in two presynaptic cells［J］.J Neurosci，2003，23：2538.

8 Rodríguez-Contreras A，Yamoah EN.Effects of permeantion concentrations on the gating of L-type Ca2+channels in hair cells［J］.Biophys J，2003，84：3457.

9 Sidi S，Busch-Nentwich E，Friedrich R，et al.Gemini encodes a zebrafish L-type calcium channel that localizes at sensory hair cell ribbon synapses［J］.J Neurosci，2004，24：4213. 10 Stamataki S，Francis HW，Lehar M，et al.Synaptic alterations at inner hair cells precede spiral ganglion cell loss in aging C57BL／6J mice［J］.Hear Res，2006，221：104.

11 Noben-Trauth K，Zheng QY，Johnson KR.Association of cadherin 23 with polygenic inheritance and genetic modification of sensorineural hearing loss［J］.Nat Genet，2003，35：21.

12 Siemens J，Lillo C，Dumont RA，et al.Cadherin 23 is a component of the tip link in hair-cell stereocilia［J］.Nature，2004，428：950.

13 Di Palma F，Holme RH，Bryda EC，et al.Mutations in Cdh23，encoding a new type of cadherin，cause stereocilia disorganization in waltzer，the mouse model for Usher syndrome type 1D［J］.Nat Genet，2003，27：103.

14 Liu K，Jiang X，Shi C，et al.Cochlear inner hair cell ribbon synapse is the primary target of ototoxic aminoglycoside stimuli［J］.Mol Neurobiol，2013，48：647.

（2014-06-23收稿）

（本文编辑 周涛）

The Changes of the Number of Ribbon Synapse in lnner Hair Cells of C57BL／6J Mice with Age

Li Xiaorui*，Jiang Xingwang，Zhang Yanping
（*Department of Otolaryngology，309thHospital of Chinese PLA，Beijing，100091，China）

Objective To investigate the number changes of the ribbon synapses（RS）in the inner hair cell of C57BL／6J mice with age.Methods The cochlear basilar membrane was obtained from C57BL／6J mice in 2，6，10，12 months old.RIBEYE on the presynaptic membrane and AMPA receptor on the postsynaptic membrane were double labeled by immunofluorescence histochemical technique.The stained sections were observed under a confocal laser-scanning microscope.Then the number of RS of the basilar membrane was calculated by three dimensional reconstruction images using 3DS max software.Results The numbers of RS reduced gradually from the cochlear apex to base in the same developing stages.The numbers of RS in apex and middle turn of cochlea were gradually reduced with the age increasing.The number of RS in basilar turn reduced first and increased slowly then.Conclusion The decreases of the number of RS maybe the main pathological change at the early stage of presbycusis.In addition，there may be a kind of compensatory mechanism by increaseing the number of RS to delay the hearing deficits.

C57BL／6J mice； Inner hair cell； Ribbon synapse

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.014

时间：2015-3-3 14：39

R764.43+6

A

1006-7299（2015）02-0176-05

△ 北京市自然科学基金面上项目（7142155）、2013年度全军保健专项科研课题（13BJZ24）、全军十二五面上项目（11MS013）、总参军事医学和老年病科研基金重点项目（ZCW14B07）、中国人民解放军第309医院院内课题面上课题（2014MS-015）联合资助

1 中国人民解放军第309医院耳鼻咽喉科（北京 100091）；2 山西医科大学

李晓瑞，女，山西人，在读硕士研究生，主要研究方向为老年性聋的发病机制。现在山西省运城市中心医院耳鼻咽喉科工作。

张延平（Email：yzhan28@163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.015.html