灭钉螺微生物的筛选及功效研究

崔国艳，汪世平，程红兵，何 鑫，闾丘思嘉，黄成铭

灭钉螺微生物的筛选及功效研究

崔国艳1,2，汪世平1，程红兵2，何 鑫1，闾丘思嘉1，黄成铭1

目的 消灭钉螺是防治血吸虫病重要工作，筛选出一种高效、低毒、持久及价廉的杀螺细菌是有意义的探索。方法 本文从钉螺孳生的土壤中筛选出具有杀螺作用的强毒菌株，分别制备成细菌发酵液、发酵上清液和菌体悬液进行浸泡杀螺比较，取得了初步结果。结果 经初筛，分离出4株(B8、B27、B36、B59)对钉螺具有毒性作用的细菌；灭螺实验结果表明，4株细菌的发酵液、发酵上清液和菌体悬液均显示出不同的毒杀作用，综合比较发现，B59菌株的灭螺效果最好，其次是B27、B36菌株，B8菌株最弱。在细菌发酵上清液各菌株间灭螺效果差异有统计学意义(χ2=21.286，P=0.002)；各菌株发酵液的灭螺效果差异也有统计学意义(χ2=17.298，P=0.008)；但各菌株菌体悬液之间的灭螺效果未显示统计学差异(χ2=7.579，P=0.271)。结论 细菌的代谢产物，尤以B59菌株的发酵上清液有较好的灭螺功效。

血吸虫病；钉螺；微生物；灭螺效果；死亡率

血吸虫病是一种严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病，主要流行于发展中国家，每年约207万人感染日本血吸虫，将近800万人受感染的威胁，且感染人数在发展中国家仍呈上升态势[1-2]。我国是日本血吸虫病流行最为严重的国家，约1亿人受血吸虫病的威胁[3]。钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，是造成日本血吸虫病流行的重要根源。目前灭螺的方法主要有3类，物理灭螺工程浩大，费事费力，灭螺效果慢，且适用范围相对较少；化学药物灭螺存在选择性弱、持久性差、价格高、易污染环境且需反复灭螺等问题[4-5]；生物灭螺环保、低廉，通过改变钉螺的孳生环境或者使用天敌，打破原有的种群平衡，环境保护意义重大[6]。微生物灭螺对非靶生物无毒性、高效、稳定，对钉螺有定向特异性。相比其它生物而言，微生物及其代谢产物具有更多的生物多样性、生长周期短、可诱导产物产生等特点[7]，是生物灭螺中较有前景的研究方向。近年来国内外学者从疫区钉螺孳生地筛选出一批灭螺微生物，但由于对其杀螺活性成份、如何致毒等问题尚不明确，因此实际应用效果并不理想[8-12]。所以在环保问题日益严峻的今天，寻找一种对人畜、农作物及水生物无害的、对钉螺杀伤力强的微生物迫在眉睫。本研究拟从钉螺孳生地的土壤中筛选出一批对钉螺具有毒杀作用的微生物，为寻找理想的灭螺微生物及其代谢产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本来源 从湖南省汨罗市血吸虫病防治研究现场实验基地钉螺池中采集土壤样本15份，毒性试验钉螺亦采自实验基地同一生态螺池中的野外钉螺,在实验室适应性饲养3 d后，挑选7-8旋活力强的成螺。

1.2 样本处理 每份土壤样本取细土10 g于三角瓶中，加入90 mL无菌蒸馏水中，摇床振荡30 min混匀，制成悬液备用。

1.3 分离培养 取制备的土壤悬液各1 mL，采用梯度稀释法稀释至10-5、10-6，取 0.2 mL涂布于LB平板上(2个平行)，30 ℃培养3～4 d观察培养细菌菌落形态。分离的菌株经3次纯化后，移至LB斜面培养基上，4 ℃保存备用。

1.4 初筛 将上述得到的纯菌株转至LB液体培养液中振荡培养48 h后，分别配制成1%菌液浸泡钉螺24～48 h，筛选出对钉螺致死率>50%的菌株。20%甘油保种，-20 ℃备用。

1.5 细菌成分的制备 将初筛得到的各纯菌株转接至LB培养液中，30 ℃振荡培养72 h，用血球计数板计数，并调整各初筛菌株的浓度为2×108个/mL；离心，收集各菌沉淀及上清液，将上清液用微孔滤膜过滤除菌后，-20 ℃保存备用；菌体沉淀用无菌水悬浮，调整其密度使其与各菌液浓度一致，4 ℃保存备用。

1.6 钉螺毒性试验

1.6.1 灭螺考核方法 将细菌发酵液(bacteria fermented liquor,BFL)、菌体悬浮液(bacteria suspension,BS)及发酵上清液(fermented supernatant,FS)分别用去氯水稀释20倍后配制成5%(v/v)的溶液。室温下，挑选野外采集的螺龄相仿、活力强的成螺，每容器投放3袋钉螺(尼龙网袋)，20只/袋，共60只钉螺，分别置于各溶液中浸泡24 h、48 h和72 h后，取出钉螺，用水逸法和敲击法测定钉螺死活，同时设去氯水和培养液为对照组，记录各组钉螺的死亡数和死亡率，每组重复3次，取其平均值。

1.6.2 杀螺效果指标 感染48 h后，钉螺死亡率超过50%以上的为有效菌株，超过90%以上为强毒株。

1.6.3 数据处理与分析 试验观察数据采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，各试验组间灭螺效果比较采用χ2检验法，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 灭螺效果观察

2.1.1 灭螺效果整体观察 从钉螺孳生土壤中共分离得到细菌96株，经过初筛，筛选出灭螺毒性较高的菌株4株，将其编号为B8、B27、B36、B59。将4株细菌的发酵液、发酵上清液和菌体悬液分别浸泡钉螺24 h、48 h、72 h。灭螺结果显示：各菌株的发酵液、发酵上清液和菌体悬液对钉螺均表现出不同的毒力，且随着时间的延长，钉螺的死亡率明显增加的趋势。从整体效果观察得出：发酵上清液灭螺效果最明显(χ2=21.286，P=0.002)，48 h对钉螺的死亡率高于65%，72 h钉螺的死亡率高于90%；其次为细菌发酵液(χ2=17.298，P=0.008)，48 h钉螺的死亡率达50%以上，72 h钉螺的死亡率高于95%；菌体悬液的杀螺效果最差(χ2=7.579，P=0.271)，48 h钉螺的死亡率低于60%，72 h对钉螺的死亡率低于80%。(表1)

2.1.2 各菌株灭螺效果观察 细菌发酵液组各组间比较结果：B8菌株与其它菌株之间差异有统计学意义(P<0.01)，B27、B36、B59菌株之间无统计学意义(P>0.05)；发酵上清液组各菌株各组间比较结果：B8-B59组与B36-B59组之间差异有统计学意义(P<0.01)，表明B59菌株灭螺效果优于B8、B36菌株，其它各组之间差异无统计学意义(P>0.05)；菌体悬液组各菌株之间比较结果：B8-B59组间差异有统计学意义(P<0.05)，其它各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。由以上结果综合比较得出：B59菌株的灭螺效果优于其它3菌株，B27、B36菌株其次，B8菌株最弱。(表2)

2.1.3 B59菌株各试验组间灭螺效果比较 B59菌株各试验组组间钉螺的死亡率比较未显示出统计学差异，P>0.05)，相对而言发酵上清液效果较好(χ2=5.439，P=0.069) (表3)

3 讨 论

从钉螺孳生土壤中分离出4株灭螺效果较好的菌株，4株菌及其代谢产物对钉螺的毒性试验表明，发酵上清液的毒力最强，48 h对钉螺的死亡率高达65%以上，72 h钉螺的死亡率高达90%以上，说明杀钉螺的有效成分主要在细菌发酵上清液中，这与郭青云等[13]的研究结果是一致的；细菌发酵液的灭螺效果次之，48 h钉螺的死亡率达50%以上，但72 h钉螺的死亡率高达95%以上，细菌发酵液对钉螺的毒力作用可能是由于细菌产生的毒素或其它代谢产物所致，郭丹钊等[14]研究报道SL-30菌株对钉螺的致死性可能是由于影响钉螺的糖代谢或蛋白合成所致；菌体悬液灭螺效果最弱，48 h钉螺死亡率不超50%；研究还发现培养液对照组对钉螺的毒力也比较强，虽然48 h钉螺死亡率不超35%，但72 h后钉螺死亡率高达90%以上，这与郭青云[13]、张桂敏[15]等研究报道不同，其原因可能是随着时间的延长，发酵液中含有Cl-对钉螺有毒害作用,亦或发酵液的盐浓度、渗透压不适合钉螺生存所致，具体原因有待进一步深入分析。

表1 分离菌株各成分浸泡不同时间灭螺效果

表2 菌株不同成分浸泡不同时间灭螺效果组间比较

表3 B59菌株各试验组间灭螺效果比较

结果表明B59菌株具有较强的灭螺效果。姚超素等[16]道，细菌“673”，0.9亿个/mL活菌室内浸泡48 h，感染钉螺2～4 d死亡率可达100%，而B59菌株感染剂量为107个/mL,48 h钉螺的死亡率可达73.3%，其感染剂量、时间及效果均优于细菌“673”；肖瑞芬等[11]报道，自养黄色杆菌感染剂量3×106个/mL，48 h钉螺死亡率57.5%，B59菌株与其相比各有所长。 有关B59菌株的鉴定、分类及其有效代谢产物的分析、鉴定，有待进一步研究。

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Screening and molluscicidal activity of microorganism againstOncomelaniahupensis

CUI Guo-yan1,2,WANG Shi-ping1,CHENG Hong-bing2,HE Xin1,LYUQIU Si-jia1,HUANG Cheng-ming1

(1.DepartmentofParasitology,XiangyaMedicalSchoolCentralSouthUniversity,Changsha410078,China;2.DepartmentofMicrobiology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China)

We screened the efficient, durable, safe and inexpensive molluscicidal microorganisms againstOncomelaniahupensisand observed the mollusicicidal effects of microorganism in this study. Bacteria with highly toxic toOncomelaniahupensiswere screened from the soil samples of habitat. The bacteria were prepared into bacterial fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension respectively. The mollusicicidal effects were tested in the experiment base of prevention and control schistosomiasis. The four strains (B8, B27, B36, and B59) which were highly toxic toOncomelaniahupensiswere isolated by preliminary screening. Results of mollusicicidal effects showed that 4 strains of bacteria different components including the fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension were in different levels of toxicity to snails. According to the comprehensive comparison, B59 strain had the excellent molluscicidal activity. The second ones were B27 and B36 strain. The last one was B8 strain. By the statistical analysis, mollusicicidal effects of the four strains were significant differences (χ2= 21.286,P=0.002). mollusicicidal effect of the four strains were also significantly different (χ2=17.298,P=0.008). mollusicicidal effects of the four strains were not significantly different in the bacteria suspension (χ2=7.579,P=0.271). The fermented supernatant of B59 strain was significantly superior to other strains by mollusicicidal effect analysis.

Schistosomiasis;Oncomelaniahupensis; microorganism; mollusicicidal effect; death rate

Wang Shi-ping, Email: wsp4373383@126.com

国家自然科学基金(No.81271862)和国家科技支撑计划(No.2009BAI78B05)联合资助

汪世平， Email: wsp4373383@126.com

1.中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室，长沙 410078； 2.长治医学院微生物学教研室,长治 046000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.003

R383.2

A

1002-2694(2015)02-0109-04

2014-10-15；

2014-11-27

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271862) and the National Technological Support Projects of China (No. 2009BAI78B05)