慢性乙型肝炎患者血清中sICOS和sPD-1升高及意义

王东生，杜 琴，刘彦信，张国元，郑德先*

(1.中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005;2.川北医学院附属医院检验科，四川南充637000)

全世界慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的人数已经超过3.5 亿，每年约有100万人死于慢性HBV 感染导致的肝硬化、重型肝炎和肝细胞癌等相关性疾病［1］。HBV 抗原诱导的细胞免疫反应是感染的乙肝病毒被清除的主要途径，同时也是导致肝细胞损伤的决定性因素［2］。免疫调节在机体抗病毒的免疫应答过程中具有重要的作用。近年来，可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator molecule，ICOS)和程序性死亡-1(programmed death 1，PD-1)共刺激分子在调节细胞免疫反应信号中的重要作用相继被证实［3］，可溶性的CD80/CD28、CD86/CTLA-4 在CHB 患者中的异常表达，越来越多的研究表明其可溶性共刺激性分子(soluble inducible co-stimulator，sICOS)，和可溶性程序性死亡分子1(soluble programmed death 1，sPD-1)与免疫功能、T 细胞的功能调节密切相关［4-6］，其异常表达可能与多种疾病有关，sICOS 在弥漫性皮肤硬化病含量明显增高和sPD-1 促进CTL 的激活、增强抗肿瘤作用均有报道［7-8］。本研究将探讨sICOS 和sPD-1 在HBV 患者中的表达水平及作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:收集2010年8月至2012年5月期间在川北医学院附属医院就诊的患者80 例，均为HBsAg 阳性，诊断均符合2000年第10 次全国病毒性肝炎及肝病学术会议所修订的病毒性肝炎诊断标准;采集标本前6 个月内均未使用过免疫调节药物、未接受抗病毒治疗，且未曾有丙肝、丁肝等病毒重叠感染以及人类免疫缺陷病(HIV)、自身免疫性疾病和其他原因引起的肝脏损伤。根据HBeAg 的阴阳性把标本分为HBeAg(+)组和HBeAg(－)组各40例，患者基本情况及相关检查见表1。30 例对照组年龄和性别与试验组相当，为川北医学院附属医院体检中心正常体检者，均为HBsAg 阴性，未曾有丙肝、丁肝、人类免疫缺陷病(HIV)、自身免疫性疾病及其他肝脏损害性疾病病史(表1)。

1.1.2 实验试剂与材料:sICOS ELISA 试剂盒(优尔生公司)，sPD-1 ELISA 试剂盒(R＆D 公司)，HBV试剂盒(雅培公司)，乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(上海科华生物工程公司)，丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(中生北控生物技术公司)。

表1 各组的基本信息和主要生化病毒学指标Table 1 Information of multiple biochemical and immunological markers in normal controls and chronic HBV patients

1.2 实验方法

1.2.1 病原学筛查及肝功酶学的检测试验:新鲜的血液标本做乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb 和HBcAb 定量实验，分析检验结果并询问临床患者的病史筛选出符合实验要求的标本。根据HBsAg 和HBeAg 的阴阳性将实验标本分为正常组、HBeAg(+)组和HBeAg(－)组。分别检测3 组实验标本的肝功酶学指标ALT、AST，并对HBeAg(+)和HBeAg(－)两组标本进行乙型肝炎病毒核酸定量的检测，该项检测的灵明度为1×103IU/mL。

1.2.2 ELISA 法检测外周血血清中sICOS 和sPD-1的含量:用sICOS 和sPD-1 的ELISA 试剂盒检测外周血血清中sICOS 和sPD-1 的含量，每一步均严格地按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 荧光定量PCR 检测PBMCs 中ICOS 和PD-1的表达:PBMCs 体外经PHA、LPS 活化前后，通过荧光定量PCR 仪检测ICOS、PD-1 和PD-1Δex3 mRNA的表达，荧光定量PCR 引物序列见表2。反应体系20 μL，上下游引物各10 pmol，扩增40 个循环，在72 ℃延伸时收集荧光信号。

1.3 统计学分析

表2 荧光定量PCR 引物Table 2 Primer of real-time quantitative PCR

2 结果

2.1 血清中sICOS 和sPD-1 的测定结果

HBeAg(+)组的sPD-1 和sICOS 含量均显著高于对照组(P＜0.01);HBeAg(－)组仅sICOS 增高(P＜0.05);HBeAg(－ )组与HBeAg(+ )组的sPD-1血清水平差异明显(P＜0.01)(图1)。

2.2 免疫耐受期和免疫清除期患者外周血上清中sICOS 和sPD-1 的测定结果

免疫清除期患者外周血上清中的sPD-1 较免疫耐受期患者明显增高(P＜0.05)(图2)。

2.3 HBV 患者的sICOS 和sPD-1 与临床生化指标ALT、AST、DNA 拷贝数及HBeAg 血清滴度的相关性分析

图1 3 组血清中sPD-1 和sICOS 蛋白水平的比较Fig 1 The comparision of sPD-1 and sICOS levels in serum of health(±s，n=30)，HBeAg(－)(±s，n=40)and HBeAg(+)group(±s，n=40)

sPD-1 与AST 呈正相关(r=0.506，P＜0.01)，HBeAg(+)组中仅sPD-1 与ALT、AST 呈中等正相关(r ＞0.5，P＜0.01)，HBeAg(+)组仅sICOS 与lgHBVDNA 呈弱的负相关性(r＜－0.4，P＜0.05)(图3)。

图2 免疫耐受期和免疫清除期患者的外周血上清中sPD-1 和sICOS 的比较Fig 2 The comparision of sPD-1 and sICOS in chronic HBV patients at immune tolerance(±s，n=17)or clearance phase(±s，n=23)

图3 HBV 患者血清中sICOS 和sPD-1 与其他生化及DNA 拷贝数等指标的相关性分析Fig 3 Correlation between sICOS or sPD-1 and other biochemical index and DNA copies in HBV patients

2.4 ICOS、PD-1 和PD-1Δex3 的检测结果

HBeAg(－)和HBeAg(+)两组的ICOS mRNA表达水平低于对照组(P＜0.05)，其余各组没有差异。以△Ct 作图(图4)。

图4 3 组外周血单个核细胞(PBMCs)体外活化前ICOS mRNA 的表达Fig 4 The mRNA levels of ICOS in three groups' PBMCs

3 讨论

HBV 感染后，首先激活机体免疫应答。此过程中T 细胞的激活需要双信号，单纯的T 细胞表面受体(TCR)-抗原肽-MHC 分子的相互作用并不能诱导T 细胞的活化，需要协同刺激分子提供的第二信号补充TCR 信号，并能将多种信号整合后启动并调控免疫应答的类型和强度［9］。

可诱导共刺激分子(inducible costimulatory molecule，ICOS)和程序性死亡-1(programmed death.1，PD-1)为免疫球蛋白超家族CD28 家族的新成员。ICOS 蛋白结构上与CD28 非常相似，均属于正性的协调刺激分子［9-10］。PD-1 与CTLA-4 具有23%的氨基酸同源性，与PD-L1 作用可以削弱、限制或终止T、B 细胞和单核细胞的活化和增殖［5］。TNF/TNFR 以及CD28/B7 家族协调共刺激分子均存在膜型和可溶性两种形式，sICOS 和sPD-1 分别为ICOS和PD-1 在血清或血浆中的可溶性形式。已有文献证明在病毒性肝炎中PD-1 的表达升高［11］。

本实验显示，与正常组相比，HBeAg(+ )组sICOS和sPD-1 的含量均增高，且在HBeAg(+)组和HBeAg(－)组的sPD-1 的差异明显，而HBeAg(－)组只有sICOS 较正常组增高。HBeAg(－)组中DNA 含量与sPD-1 及sICOS 均无相关性，HBeAg(+)组的sICOS 与乙肝DNA 拷贝数呈弱相关，乙肝病毒复制可能与这几个分子相关性较小。但是与肝功能受损的酶学指标AST、ALT 均没有相关性。而sPD-1 仅在HBeAg(+)组与正常人的比较中升高，并与HBeAg(+)组的肝功酶学指标AST、ALT有密切的相关性。两者相比较而言，sPD-1 与CHB患者感染的活动性更密切相关，与HBV 的活动性可能存在潜在的关系。ICOS、PD-1 在肿瘤、感染以及自身免疫性疾病中均有异常表达，HBeAg(+)组患者外周血中sICOS 和sPD-1 的异常表达可能也与机体的免疫应答有关。免疫清除期患者血清中的sPD-1 明显高于免疫耐受期患者。PD-1 基因敲除的小鼠模型证明PD-1 介导的负性调节对免疫耐受具有重要的作用［12］。sPD-1 (即PD-1 的胞外段)能特异性地结合PD-L1(PD-1 的配体)，阻断PD-1/PD-L1 的相互作用［13］，从而维持免疫稳态。HBV 中含量增高的sPD-1 可能拮抗PD-1/ PD-L1 的负性作用，增强T 细胞的活性，增加乙肝特异性T 细胞的存活和发挥功能的时间。

本实验首次对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中sICOS 和sPD-1 表达水平进行研究，为研究HBV 的发病机制和治疗提供了新方向，其在免疫应答中具体的作用机制有待进一步研究。

［1］成军.现代肝炎病毒分子免疫学［M］.北京:科学出版社，2011:567-568.

［2］史鸣树，闵建荣.乙型病毒性肝炎［M］.北京:人民军医出版社，2009:74-75.

［3］Coyle AJ，Gutierrez-Ramos JC.The role of ICOS and other costimulatory molecules in allergy and asthma［J］.Springer Semin Immun，2004，25:349-359.

［4］Cao J，Zhang LP，Huang SF，et al.Aberrant production of soluble co-stimulatory molecules CTLA-4 and CD28 in patients with chronic hepatitis B［J］.Microbial Pathogenesis，2011，51:262-267.

［5］Gao Q，Wang XY，Qiu SJ，et al.Overexpression of PD-L1 Significantly Associates with Tumor Aggressiveness and Postoperative Recurrence in Human Hepatocellular Carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15:971-979.

［6］Nielsen C，Ohm-Laursen L，Barington T，et al.Alternative splice variants of the human PD-1 gene［J］.Cell Immunol，2005，235:109-116.

［7］Yanaba K，Asano Y，Noda S，et al.Increased production of soluble inducible costimulator in patients with diffuse cutaneous systemic sclerosis［J］.Arch Dermatol Res，2013，305:17-23.

［8］邱惠，张慧，冯作化，等.分泌型重组多肽sPD1-CellⅠ(P/C-1)调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤效应的研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006，26:1053-1058.

［9］曹雪涛.免疫学前沿进展［M］.北京:人民卫生出版社，2011，12:369-396.

［10］张云志.ICOS-B7h 研究进展［J］.中国免疫学杂志，2004，7:507-509.

［11］周俊英，魏峰，李俊卿.程序性死亡受体-1 与丙型病毒性肝炎［J］.基础医学与临床，2010，30:1218-1221.

［12］韩凌斐，张桂梅，刘毅，等.sPD-1 和4-1 BBL 体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用［J］.中华微生物学与免疫学杂志，2006，26:831-835.

［13］Her M，Kim D，Oh M，et al.Increased expression of soluble inducible costimulator ligand(ICOSL)in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Lupus，2009，18:501-507.