陕西省800例非综合征型聋患者常见致聋基因突变分析*

梁鹏飞 王淑娟 王剑 陈阳 邱建华

陕西省800例非综合征型聋患者常见致聋基因突变分析*

梁鹏飞1王淑娟1王剑1陈阳1邱建华1

目的 分析陕西省非综合征型聋患者常见耳聋基因突变方式及频率，了解其耳聋发病的分子机制。方法 采集陕西省800例非综合征型聋患者外周血，提取基因组DNA，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及线粒体12S r RNA 1494和1555位点进行直接测序，序列与NCBI网站公布的标准序列进行比对分析。结果 800例非综合征型聋患者中，共353例（44.13%）患者携带耳聋致病基因突变，其中153例（19.13%）携带GJB2基因双等位基因突变，GJB2基因最常见的突变方式为235delC，检出率为13.5%（216／1 600）；123例（15.38%）携带SLC26A4基因双等位基因突变，SLC26A4基因最常见突变方式为IVS7-2A＞G，检出率为7.44%（119／1 600）；1例携带线粒体12S r RNA1494C＞T均质性突变，15例携带1555A＞G均质性突变；2例患者携带GJB3基因c.538C＞T杂合突变。294例（36.75%，294／800）患者由上述基因突变导致耳聋。结论 陕西省非综合征型聋患者中，GJB2基因以及SLC26A4基因的突变携带率与全国以及西北地区平均水平较为一致，而线粒体基因突变的携带率偏低。

非综合征型聋； 基因； 突变

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20141231.1128.006.html

听力障碍是最常见的先天性缺陷和神经感觉障碍疾病［1］，据2006年全国第二次人口普查统计，我国听力残疾人群占全国各类残疾人总数的33.5%，居各类残疾的第二位［2］。引起耳聋的原因有多种，其中遗传因素导致的听力损失在儿童耳聋患者中的比例高达50%～60%［3］。耳聋分子流行病学调查显示，GJB2、GJB3、SLC26A4基因以及线粒体12S r RNA 1555、1494位点突变是引起非综合征型聋的主要遗传因素［4～6］，然而，不同种族、地区的耳聋人群基因突变频度有明显的差异［4］。为了解陕西省散发重度感音神经性聋患者的基因突变热点和发生频率，本研究采取基因测序法，对陕西省800例非综合征型聋患者进行上述4项基因筛查，分析此类患者中常见致聋基因的致病特征，为陕西省耳聋防治工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 受检对象为2009年至2013年就诊于第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科、有基因检测诊断愿望的感音神经性聋患者。均为汉族，散居于陕西省各地。全部患者均完成纯音听阈测试、声导抗、耳声发射、听性脑干反应以及颞骨CT扫描（婴幼儿同时行听性稳态反应）检查及全耳评估，排除综合征型聋患者。接受基因检测的患者均进行详细的病史采集，包括基本信息、耳聋相关病史、既往史、家族史以及患儿母亲孕期身体状况、用药史、外伤史等。根据病史描述排除与国外种族联姻家族或近亲联姻家族者，排除有明显外耳、中耳畸形的患者。最终入选本研究的患者共800例，男427例，女373例，年龄1～49岁，平均7.75±8.88岁，均为非综合征型感音神经性聋，有家族史者只计入先证者。

800例非综合征型聋患者中，语后聋15例，语前聋785例，有明确耳毒性药物用药史74例，有明确耳聋家族史124例，142例患者颞骨CT和／或MRI显示前庭水管扩大。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取方法 患者或其监护人签署知情同意书后，抽取被检测者外周静脉血3～5 ml，枸橼酸钠抗凝，采用百泰克中量全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA，使用分光光度计检测纯度，满足OD260／280＝1.7～2.0，取适量样本稀释至浓度100～200 ng／μl，剩余置-80℃保存。

1.2.2 引物 GJB2、SLC26A4以及线粒体DNA引物序列参照戴朴等［7］研究，GJB3基因引物使用袁永一等［8］研究报道的引物序列。所有引物由华大基因合成。

1.2.3 PCR反应 PCR反应采用50μl体系，包括2×Pfu PCR Master Mix 25μl，10μM的上下游引物各1μl，DNA模板2μl，dd H2O 21μl，PCR扩增条件采用Touchdown方法，如图1所示。

图1 PCR反应条件

1.2.4 PCR产物测序与分析 基因扩增产物经纯化后，使用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，由于GJB2基因和GJB3基因扩增片段较大，需进行双向测序，测序引物与PCR扩增引物相同；结果使用Chromos软件读取并利用DNAMAN软件与美国国立生物技术中心（NCBI）数据库提供的GJB2、GJB3、SLC26A4及DNA 12Sr RNA的标准序列进行比较分析，以筛查是否存在突变位点。对于GJB2基因的检测结果，与http：／／davinci.crg.es／deafness／网站公布的突变数据比对，明确突变位点是否为已知致病突变；对于SLC26A4基因突变的致病性，查阅文献后，同时利用pilyphen及SIFT网站进行预测。

2 结果

800例非综合征型聋患者中，共353例（占44.13%）患者携带耳聋致病基因突变。

2.1 GJB2基因突变检测结果 本研究共检出29种GJB2基因突变序列改变方式，共有191例携带GJB2基因病理性突变，占23.88%（191／800），其中，双等位基因突变153例（19.13%，153／800）（纯合突变77例，复合杂合突变76例）；单等位基因突变38例。有7例患者检出GJB2基因双等位基因突变并SLC26A4基因单等位基因突变。表1中列出了检出率较高的四种突变方式，分别为233-235delC、299-300delAT、176-191del16bp以及R143W，等位基因检出率分别为10.25%、4.13%、1.75%和0.5%。另有5.88%（47／800）的患者携带GJB2基因其他非多态性突变方式。

2.2 SLC26A4基因突变检测结果 本研究共检出57种SLC26A4基因突变序列改变方式，有151例患者携带SLC26A4基因病理性突变（其中134例颞骨CT诊断为前庭水管扩大），占18.88%（151／800），其中双等位基因突变123例（纯合突变21例，复合杂合突变102例），单等位基因突变28例。有4例患者为SLC26A4基因双等位基因突变并携带GJB2单杂合突变，1例患者为SLC26A4基因单杂合突变并线粒体1555A＞G阳性。检出率最高的突变方式为IVS7-2A＞G，纯合突变17例，杂合突变85例，等位基因检出率为7.44%（119／1600）；其他三种检出率较高的突变方式分别为H723R、IVS15 +5G＞A以及N392Y，等位基因检出率分别为2.19%、0.63%和0.5%。本研究检测到6例患者同时携带三种突变形式的杂合突变。表2显示了SLC26A4基因常见突变方式的发生频率。

2.3 线粒体12SrRNA基因突变检测结果 800例耳聋患者中，A1555G突变阳性15例，C1494T突变阳性1例，总检出率为2.0%（16／800）；其中有2例幼儿患者和1例成年男性患者无明确氨基糖苷类抗生素用药史，这3例患者的听力表现及家庭成员基因型见表3。基因检测结果显示，三个家庭的母亲均为A1555G突变阳性，患者的突变基因均来自于母亲。

耳聋前有明确耳毒性药物用药史的74例患者中，12例患者为线粒体12SrRNAA1555G突变阳性，1例患者为线粒体12SrRNAC1494T突变阳性，10例患者为SLC26A4双等位基因突变，10例患者为GJB2双等位基因突变。

表1 800例非综合征型聋患者中GJB2基因常见突变形式检出率

表2 800例非综合征型聋患者中SLC26A4基因常见突变形式检出率

表3 3例A1555G突变阳性但无氨基糖苷类抗生素用药史患者的临床资料

2.4 GJB3基因突变检测结果 800例患者中，有2例患者携带c.538C＞T单等位基因突变，并未携带其他基因突变，一例患者为男性，6岁，无言语发育，表现为全频重度感音神经性聋；另一例患者也为男性，8岁，自幼听力较差，听力下降加重1年余，有简单言语发育，1～4kHz重度感音神经性聋。均无耳聋家族史。验证父母基因型发现，患者的突变基因均来自父母中的一位，但父母听力均正常，无言语交流障碍。

3 讨论

国内大量研究表明，GJB2基因、SLC26A4基因以及线粒体12SrRNAA1555G、C1494T突变是引起国人非综合征型聋最常见的原因，在耳聋人群中的携带率分别为21%、14.5%、3.4%和0.6%［9～11］。王秋菊等［12］报道西北地区耳聋患者中GJB2、SLC26A4以及线粒体12S r RNA A1555G的突变发生率分别为19.9%、15.6%和9.15%。陕西省为西北人口大省，2006年残疾人抽样调查显示，全省听力残疾人79.8万［13］，目前尚无陕西省听力残疾人群分子病因学调查报告。本研究选取800例散发非综合征型聋患者为研究对象，调查发现GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体12S r RNA病理性突变发生率分别为23.88%、18.88%和2%，与全国及西北地区流行病学调查数据相比较为一致。

GJB2基因突变是导致陕西省非综合征型聋最常见的原因，本研究中19.13%的患者由GJB2双等位基因突变所致。大规模分子流行病学调查显示，不同种族地区耳聋人群GJB2基因的突变频率和突变热点不同，本研究800例非综合征聋患者中，235delC突变检出率最高（13.5%），299-300del AT次之（4.13%），176del16bp再次之（1%），与文献中报道的西北地区GJB2基因热点突变频度一致。除了少数具有显性致病性的突变方式外，GJB2基因的大部分突变方式表现为隐性遗传，所以由GJB2基因突变致聋的患者，若配偶完全不携带任何GJB2致聋突变，其生育听力正常后代的可能性与正常人相当。值得注意的是，由GJB2基因突变导致的耳聋多表现为重度听力损失，且发病年龄主要集中在婴幼儿时期［14］，可被早期发现，有利于早期干预和治疗。

SLC26A4基因突变可导致前庭水管扩大及Pendred综合征。本研究对象中有142例患者经颞骨CT诊断为前庭水管扩大，这142例中，134例患者检出携带SLC26A4基因突变，其中123例为SLC26A4双等位基因突变。前庭水管扩大导致的耳聋为隐性遗传性疾病，双等位基因突变可以导致耳聋表型的发生，携带SLC26A4基因单杂合突变的前庭水管扩大患者中，是否在基因调控区存在另外的突变位点，由于目前的筛查方法无法检测到，仍不能排除该基因的致病性。本研究结果显示，SLC26A4基因最常见突变方式为IVS7-2A＞G，突变检出率为7.44%。SLC26A4基因的突变方式多样，在各个外显子内均有分布，本研究检测结果显示，123例由双等位基因突变致聋的患者中，102例的基因型为复合杂合突变，提示对于诊断为前庭水管扩大、尤其是普通热点筛查为单杂合突变的患者，需要进行SLC26A4基因全外显子测序，以明确其基因型，找到致聋原因。

本研究中线粒体12S r RNA A1555G以及C1494T阳性率（2.0%）与既往文献数据［12］相比偏低，分析可能与本研究选取的研究对象有关。12S r RNA致病性与氨基糖苷类药物的应用高度相关，而本研究并未侧重于药物性聋的收集；其次，由线粒体基因突变导致的耳聋表现为母系遗传特质，具有家族聚集性，母系亲属中往往有多人携带同样突变出现相似耳聋症状，但本研究只选择其中一例作为研究对象；再者，既往学者对于西北地区或是陕西省的研究对象往往来自于较大城市的聋校，而本研究对象来自于全省各个地市的散发病例，人员相对分散，统计数据更具代表性。

线粒体A1555G及C1494T阳性个体对氨基糖苷类抗生素（Am An）的耳毒性并不呈现剂量依赖，很小用量即可导致耳聋。Estivill等［15］认为A1555G导致的耳聋与年龄相关，在未应用Am An的A1555G阳性个体中，40%的人在30岁左右出现听力障碍，随着年龄增长耳聋个体增多，程度加重。无Am An应用史的A1555G阳性个体听力损失多为轻至中度［16］。但本文表3中的先证者3例外，其家属表示患者自幼耳聋，且并未应用Am An，患者母亲同样为A1555G阳性但听力正常，推测患者幼年可能接触某些氨基糖苷类药物，但并未引起家属的重视或被遗忘。线粒体DNA具有明显母系遗传特质，故应明确告知其家系中的所有母系成员及其后代，要避免应用此类药物，尽量保护听力。74例有明确耳毒性药物应用史的患者中，12例为线粒体12Sr RNA A1555G阳性，1例为线粒体12Sr RNA C1494T阳性，这13例患者可明确因线粒体突变而致聋，占17.56%（13／74）；还有10例患者为SLC26A4双等位基因突变，10例患者为GJB2双等位基因突变，故耳毒性药物并不是这些患者最关键的致聋原因，即使有明确Am An药物应用史的耳聋患者，GJB2及SLC26A4基因的筛查对于明确其分子学病因仍是非常必要的。74例中还有41例患者并未检出突变，为排除线粒体DNA基因突变的致聋性，仍需继续排查线粒体其他位点。

GJB3基因由夏家辉院士在研究中国两个常染色体显性遗传性非综合征型聋家系时定位并克隆［17］，该研究团队认为E183K（c.547G＞A）以及R180X（c.538C＞T）突变方式与高频听力下降有关。王帅［18］等研究发现突变的Cx31蛋白无法转运至细胞间隙，不能形成间隙连接通道，干扰了间隙连接结构的功能，无法介导正常的细胞间连接通讯。本研究发现2例患者携带c.538C＞T杂合突变，这2例GJB3突变阳性患者的父母尽管携带相同突变，但听力无明显异常，本研究在100例听力正常对照组的筛查中，也发现1例成年人携带相同突变。因此GJB3 R180X突变对听力的影响仍需进一步研究。

本研究分析了陕西省非综合征型聋患者相关耳聋致病基因突变，丰富了中国人群常见耳聋基因突变频率统计资料，为294例（153+123+16+2）36.75%（294／800）耳聋患者明确了分子学病因，同时了解了陕西省非综合征型聋患者相关致病基因的突变特征，为开展耳聋的早期诊断、早期预防以及耳聋家庭的遗传咨询提供了理论依据。

1 Hilgert N，Smith RJ，Van Camp G.Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment：which ones should be analyzed in DNA diagnostics［J］？Mutat Res，2009，681：189.

2 国家统计局第二次全国残疾人抽样调查领导小组.第二次全国残疾人抽样调查主要数据公报［E］.人民日报，（2）.

3 王秋菊.新生儿聋病基因筛查-悄然的革命［J］.听力学及言语疾病杂志，2008，16：83.

4 戴朴，于飞，韩冰，等.中国不同地区和种族重度感音神经性聋群体热点突变的分布和频率研究［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42：804.

5 刘晓雯，郭玉芬，韩东一，等.非综合征型聋患者线粒体DNA A1555G突变频率分析［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42：739.

6 赵亚丽，翟所强，王秋菊.大前庭水管综合征及其相关的基因--SLC26A4［J］.中华耳科学杂志，2005，3：289.

7 戴朴，于飞，康东洋，等.线粒体DNA1555位点和GJB2基因及SLC26A4基因的诊断方法及临床应用［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2005，40：769.

8 袁永一，黄德亮，于飞，等.GJB3在携带GJB2单等位基因突变的中国耳聋人群中的突变分析［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，45：287.

9 Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2 mutation spectrum in 2，063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment［J］.J Transl Med，2009，7：26.

10 Yuan Y，Guo W，Tang J，et al.Molecular epidemiology and functional assessment of novel allelic variants of SLC26A4 in non-syndromic hearing loss patients with enlarged vestibular aqueduct in China［J］.PLoS One，2012，7：e49984.

11 Dai P，Liu X，Han D，et al.Extremely low penetrance of deafness associated with the mitochondrial 12S r RNA mutation in 16 Chinese families：implication for early detection and prevention of deafness［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，340：194.

12 王秋菊，韩东一，郭玉芬，等.遗传性耳聋资源收集保存及基因定位克隆［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2006，13：661.

13 孙斌，许珉，康全清，等.陕西省听力残疾抽样调查分析［J］.中华耳科学杂志，2007，5：355.

14 崔庆佳，王国健，张媛，等.GJB2、SLC26A4基因相关耳聋儿童的听力损失特点分析［J］.听力学及言语疾病杂志，2014，22：120.

15 Estivill X，Govea N，Barcelo E，et al.Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by treatment of aminoglycosides［J］.Am J Hum Genet，1998，62：27.

16 Bai YH，Ren CC，Gong XR，et al.A maternal hereditary deafness pedigree of the A1555G mitochondrial mutation，causing aminoglycoside ototoxicity predisposition［J］.J Laryngol Otol，2008，122：1037.

17 Liu XZ，Xia XJ，Xu LR，et al.Mutations in connexin31 underlie recessive as well as dominant non-syndromic hearing loss［J］.Hum Mol Genet，2000，9：63.

18 王帅，魏钦俊，范燚，等.耳聋基因GJB3c.538C〉T突变致病性效应的初步研究［J］.医学分子生物学杂志，2013，10：10.

（2014-06-17收稿）

（本文编辑 李翠娥）

A Genetic AnaIysis of 800 Non-syndromic Deafness Patients from Shanxi Province

Liang Pengfei，Wang Shujuan，Wang Jian，Chen yang，Qiu Jianhua
（The PLA OtoIaryngoIogy-Head and Neck Surgery Center，Xijing HospitaI，the Fourth MiIitary MedicaI University，Xi＇an，710032，China）

Objective The patients with non-syndromic deafness in Shanxi Province were retrospectively analyzed for the common deafness gene mutations and frequency of mutations carrying rate，to understand the molecular pathogenesis of deafness in Shanxi area.Methods Genomic DNAs of 800 patients of non-syndromic deafness within Shanxi were obtained from peripheral blood.Genes GJB2，GJB3，SLC26A4 and mitochondrial 12Sr RNA 1494 and 1555 loci were sequenced after polymerase chain reaction（PCR）amplification and compared with the NCBI website for the analysis of the formation of mutations.ResuIts Among 800 patients，353 cases（44.13%）showed detected deafness related mutations and the genetic etiology was found for 294 patients（36.75%）.Among them，153 cases（19.13%）carried double allele mutations in the GJB2 gene.The most frequent mutation of GJB2 gene was 235delC，and the carrying rate was 13.5%（216／1 600）.The double mutant allele of SLC26A4 gene was detected in 123 cases（15.38%），and the most common mutation was IVS7-2A＞G，identified in 7.44%（119／1 600）of patients.Homogenic mitochondrial 12S r RNA 1494C＞T mutation in one patient and 1555A＞G mutation in 15 patients were detected.GJB3 gene c.538C＞T heterozygous mutation was found in two patients.Altogether，36.75%（294／800）of patients with deafness were caused by gene mutations.ConcIusion The data containing GJB2 gene and SLC26A4 gene carrying rate are consistent with the published data of non-sy ndromic deafness in theNorthwest region of China，but the carrying rate of mitochondrial gene mutations is lower than the average level of China.Our data show that the gene mutations contribute to 36.75%of etiology in patients with deafness.This study reflects the importance of deafness related genes screening in Shanxi area for early diagnosis and genetic consultation.

Non-syndromic deafness； Gene； Mutation

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.01.003

时间：2014-12-31 11：28

R764.43+1

A

1006-7299（2015）01-0011-05

* 国家“973”项目课题（2011CB504500）和国家自然科学基金（81300832）联合资助

1 第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科（西安 710032）

梁鹏飞，女，河北人，技师，硕士，主要研究方向为耳聋的分子病理学。

邱建华（Email：qiujh@fmmu.edu.cn）

·临床研究·