侧裂区低级别脑胶质瘤中MMP家族水平的检测及其与预后情况分析

张　诚，刘艳辉

(四川大学华西医院神经外科，成都 610041)

侧裂区低级别脑胶质瘤中MMP家族水平的检测及其与预后情况分析

张诚※，刘艳辉

(四川大学华西医院神经外科，成都 610041)

摘要：目的研究侧裂区低级别脑胶质瘤中基质金属蛋白酶(MMP)家族水平的检测及其与预后情况的相关性。方法将2007年1月至2010年12月四川大学华西医院收治的130例侧裂区Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤患者作为观察组，选择同期收治的30例颅脑损伤患者作为对照组，检测组织中MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平，并随访观察组患者的预后情况。结果观察组患者肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的mRNA水平分别为233±35、253±32，均高于对照组的100±15、100±19，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组患者肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的蛋白阳性率分别为63.8%(83/130)、62.3%(81/130)，均高于对照组的13.3%(4/30)、16.7%(5/30),差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-2、MMP-9阳性患者的无瘤生存时间短于阴性患者，1年复发率、3年复发率高于阴性患者(P<0.05)；MMP-2、MMP-9是胶质瘤患者1年复发(OR=2.275，2.311)、3年复发(OR=2.291，2.541)的危险因素。MMP-2、MMP-9阳性患者的无瘤生存时间短于阴性患者(P<0.05)，1年复发率、3年复发率高于阴性患者(P<0.05)；MMP-2、MMP-9是胶质瘤患者1年复发、3年复发的危险因素。结论MMP-2、MMP-9的表达与侧裂区脑胶质瘤患者的预后密切相关，MMP-2、MMP-9阳性患者的远期复发率较高。

关键词：脑胶质瘤；基质金属蛋白酶；复发

胶质瘤是神经系统的常见肿瘤，其本身的致瘤性和侵袭性会对患者的神经功能造成较大损害，且手术治疗后的复发率较高[1]。侧裂区脑胶质瘤是围绕外侧裂区域生长的一类胶质瘤，该区域血管分支丰富、供应范围较广，手术切除难度较大，且术后复发后的处理也十分棘手[2]。胶质瘤细胞浸润性生长是导致肿瘤复发的最根本原因，肿瘤浸润的过程与基膜降解、血脑屏障破坏密不可分。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族是一类参与细胞外基质降解、肿瘤组织侵袭的蛋白酶类物质，且与脑胶质瘤的浸润过程密切相关[3]。本研究从患者远期预后的角度分析侧裂区脑胶质瘤中MMP家族的表达量及其临床意义，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2007年1月至2010年12月四川大学华西医院收治的130例侧裂区Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤患者作为观察组，患者均符合侧裂区脑胶质瘤的诊断标准，收住院后进行显微手术切除治疗，其中男73例、女57例，年龄39～62岁，平均(47±6)岁。将同期收治的30例颅脑损伤患者作为对照组，患者收住院后接受减压手术，其中男17例、女13例，年龄35～66岁，平均(48±7)岁。两组患者的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2试剂免疫组织化学试剂盒和常规试剂购买于上海碧云天生物技术有限公司，抗体购买于Abcam公司；RNA提取试剂、反转录试剂、实时定量聚合酶链反应检测试剂购买于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3方法

1.3.1聚合酶链反应检测方法取组织采用天根生化科技(北京)有限公司的mRNA抽提试剂盒提取mRNA，而后反转录合成cDNA第一链；采用实时定量聚合酶链反应试剂盒检测mRNA水平，扩增体系：cDNA 2 μL、含染料的反应液 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、去离子水7.0 μL，扩增调节：95 ℃、15 s、特异性退火温度、25 s，72 ℃、35 s。分别扩增看家基因actin及目的基因MMP-2、MMP-9，设定对照组血清中目的基因mRNA的水平为100，通过ΔΔCt计算对照组血清中目的基因的mRNA水平。

1.3.2免疫组织化学法脑组织固定于4%多聚甲醛，常规石蜡包埋后以蜡块形式保存。检测时，连续切片后制作石蜡切片，微波加热进行抗原修复，逐步脱蜡至水，滴加1∶300的MMP-2和MMP-9第一抗体，4 ℃湿盒孵育过夜，而后滴加Envision 第二抗体，37 ℃湿盒孵育30 min。最后显色、冲洗、复染、封片，镜下观察。阳性染色细胞呈棕褐色或棕黄色，MMP-2 和MMP-9阳性染色位于细胞质。免疫组织化学阳性评价标准[4]：无阳性细胞为“-”、阳性细胞计数≤25%为“+”、阳性细胞计数>25%～50%为“++”、阳性细胞计数>50%为“+++”。“-”和“+”判断为基因表达阴性，“++”“+++”判断为基因表达阳性。

1.3.3随访方法随访开始时间为侧裂区脑胶质瘤手术当日，随访截止时间为2013年12月。随访形式：门诊随访、电话随访、家庭访视。随访内容包括肿瘤复发情况、远处转移情况和存活情况。

2结果

2.1两组患者MMP-2和MMP-9的表达情况观察组患者肿瘤组织中MMP-2和MMP-9的mRNA水平高于对照组，蛋白阳性率也高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　两组患者脑组织中MMP-2和MMP-9的表达情况

MMP：基质金属蛋白酶；观察组：侧裂区Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤患者；对照组：颅脑损伤患者；a为t值，余为χ2值

2.2胶质瘤患者预后情况的单因素分析MMP-2、MMP-9阳性患者的无瘤生存时间短于阴性患者，1年复发率、3年复发率高于阴性患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　胶质瘤患者预后情况的单因素分析结果

MMP：基质金属蛋白酶

2.3胶质瘤患者1年复发情况的Cox回归分析对1年复发情况进行Cox回归分析，采用向后筛选法，MMP-2、MMP-9均纳入方程，结果显示，MMP-2、MMP-9是胶质瘤患者1年复发的危险因素(OR=2.275，2.311)。见表3。

表3　胶质瘤患者1年复发的多因素Cox回归分析

MMP：基质金属蛋白酶

2.4胶质瘤患者3年复发情况的Cox回归分析对3年复发情况进行Cox回归分析，采用向后筛选法，MMP-2、MMP-9均纳入方程，结果显示，MMP-2、MMP-9是胶质瘤患者3年复发的危险因素(OR=2.291，2.541)。见表4。

表4　胶质瘤患者3年复发的多因素Cox回归分析

MMP：基质金属蛋白酶

3讨论

侧裂区脑胶质瘤是指围绕外侧裂区域生长的脑胶质瘤，多累及额叶、颞叶、导叶、顶叶以及基底节、丘脑。侧裂区内血管丰富，分支供应的范围较广，包括躯体的运动中枢、感觉中枢、语言中枢的血供均来自侧裂区内的血管，这就给手术带来了极大的难度。近年来，随着显微手术技术的发展，侧裂区胶质瘤的切除效果得到了明显的改善[5]。但由于胶质瘤本身的致瘤性和侵袭性，患者在手术切除后的复发率较高，多数患者在接受手术、放化疗等综合治疗后仍在3年内再次发生胶质瘤[6]。胶质瘤最重要的生物学特性是浸润性生长，这也是导致胶质瘤患者术后复发的根本原因[7]。

MMP家族是一类含有Zn2+的蛋白水解酶，参与细胞外基质结构重塑、改型和降解，参与肿瘤新生血管的形成以及向周围的侵袭、转移[8]。迄今为止，已被研究和发现的MMP超过了20种，Sun等[9]研究认为，MMP家族的活化是参与细胞外基质降解的关键限速步骤。本研究结果显示，观察组患者肿瘤组织中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白阳性率均高于对照组，提示MMP-2和MMP-9的过度表达与胶质瘤的发生、发展密切相关。

在此基础上，本研究还对侧裂区脑胶质瘤患者的预后情况进行了单因素分析，结果显示，MMP-2、MMP-9阳性患者的无瘤生存时间短于阴性患者，1年复发率、3年复发率高于阴性患者，提示肿瘤组织中MMP的表达可以影响患者的远期预后。隋锐等[10]研究发现，在胶质瘤组织中，MMP-2和MMP-9的mRNA水平、蛋白水平均显著升高；而Jung等[11]在体外培养的细胞实验中发现，MMP降解层粘连蛋白后可产生具有催化活性的可溶性片段，参与肿瘤细胞的免疫应答反应、迁移和侵袭过程等。

近年来，越来越多的临床学者开始关注胶质瘤的生物学行为及其分子机制，也逐步认识到胶质瘤的恶性生物学行为受多种分子机制的同时作用[12]。这也意味着胶质瘤患者的预后情况受到多种因素的共同影响，不能仅用一种分子或一种蛋白对疾病的预后进行一元化解释。基于以上单因素分析的结果，本研究初步推测MMP-2、MMP-9的表达与患者的无瘤生存、肿瘤复发情况密切相关。为了进一步明确两种MMP分子在胶质瘤患者远期预后中的作用，进一步进行多因素分析，结果显示，MMP-2、MMP-9胶质瘤患者是1年和3年复发的危险因素。

综上所述，MMP-2、MMP-9的表达与侧裂区脑胶质瘤患者的预后密切相关，MMP-2、MMP-9阳性患者的远期复发率较高。

参考文献

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Detection of MMP Family Levels in Lateral Fissure Area Low Grade Glioma and PrognosisZHANGCheng，LIUYan-hui.(DepartmentofNeurosurgery,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract:ObjectiveTo study the levels of matrix metalloproteinase(MMP) family in lateral fissure area low grade glioma and its correlation with prognosis.MethodsTotal of 130 patients with lateral fissure area gradeⅠ and Ⅱ glioma in West China Hospital of Sichuan University from Jan.2007 to Dec.2010 were enrolled in observation group and another 30 brain injury patients in the same period were enrolled in control group.Then mRNA and protein levels of MMP-2,MMP-9 were detected,and the prognosis were followed up.ResultsmRNA levels of MMP-2,MMP-9 in tumor tissue of the observation group were 233±35 and 253±32,higher than the control group(100±15 and 100±19),the differences were statistically significant(P<0.05).The positive rate of MMP-2,MMP-9 protein in tumor tissue of the observation group were 63.8%(83/130) and 62.3%(81/130),which were higher than the control group[13.3%(4/30) and 16.7%(5/30)],the differences were statistically significant(P<0.05).Tumor free survival time of MMP-2,MMP-9 positive patients was shorter than negative patients,and the 1-year and 3-year recurrence rate were higher than the negative patients(P<0.05).MMP-2 and MMP-9 were risk factors of 1-year recurrence(OR=2.275,2.311)and 3-year recurrence(OR=2.291,2.541).ConclusionMMP-2 and MMP-9 expression are closely correlated with prognosis of lateral fissure area glioma patients;long-term recurrence rate of MMP-2,MMP-9 positive patients is higher.

Key words:Glioma; Matrix metalloproteinase; Recurrence

收稿日期：2014-09-09修回日期：2015-02-07编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.051

中图分类号：R739.4

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3210-03