亚硝酸盐对大鼠挤压综合征模型缺血／再灌注引起的肌肉损伤的影响

2015-03-14邢兆国常军英贾东昭王彦志穆卫庐李琦军

河北医科大学学报 2015年5期

邢兆国，常军英，贾东昭，王彦志，穆卫庐，李琦军

（河北省石家庄市第三医院创伤一科，河北石家庄050011）

挤压综合征（crush syndrome，CS）是一种严重的疾病，特点是循环性休克和肾衰竭，常发生在地震、山体滑坡和车辆事故等灾难性事件中［1］。四肢肌肉在长时间挤压（缺血）再解除挤压（再灌注）后即可发生CS，导致肌肉细胞破裂，即横纹肌溶解［2］。目前，CS的推荐治疗方案是生理盐水及时补液，碳酸氢盐和甘露醇纠正高钾血症，严重急性肾损伤时进行血液透析，否则病死率升高。Nicholson等［3］报道，在缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）大鼠的心脏和肝脏细胞中，亚硝酸盐通过缺氧依赖的信号转导通路对细胞起保护作用。在组织缺血的动物模型，亚硝酸盐给药前或在再灌注期间，可以防止I／R损伤导致的心肌梗死、脑卒中和肾损伤［4］。然而，到目前为止，一直没有实验证据显示亚硝酸盐对于CS的治疗效果。因此，本研究制备大鼠CS模型，观察亚硝酸盐治疗对肌肉细胞的损伤、血流动力学和炎症过程以及存活率的影响，旨在为临床治疗提供证据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物模型的建立与分组雄性SD大鼠140只，均购于河北省实验动物中心，体质量250～300 g，其中40只随机分为对照组、CS组、CS＋亚硝酸钠（NaNO2）-100 组、CS＋NaNO2-200 组、CS＋NaNO2-400组各8只。对照组不挤压；CS组、CS＋NaNO2-100组、CS＋NaNO2-200组、CS＋NaNO2-400组均采用自制挤压器械，压力为3kg，连续挤压大鼠双下肢6h造成肢体挤压伤后，再分别灌注生理盐水以及不同剂量 NaNO2（100、200和400 μmol／kg）6h。另外100只用作计算生存率。

1.2 血液和组织取样再灌注6h后，各组大鼠取股动脉血，应用血液气体分析仪检测pH、HCO3-和碱剩余值。取下腔静脉血，4℃，5 000r／min，离心10min，利用SRL测量血浆钾、肌酸激酶（creatinekinase，CK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。取腓肠肌和肺组织标本进行髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的测量。

1.3 肌肉和血浆中的亚硝酸盐和硝酸盐含量测定采用专用的高性能液相色谱系统检测肌肉和血浆中的亚硝酸盐浓度。此方法是基于用离子色谱法分离的亚硝酸盐和硝酸盐，然后由硝酸盐还原成亚硝酸盐，在540nm处检测。利用甲醇沉淀去除每个样品中的蛋白质（肌肉：甲醇=1∶2质量／体积；血浆：甲醇=1∶1体积／体积，4℃）。

1.4 平均动脉压（mean arterial blood pressure，MAP）的记录和分析再灌注后，各组腹腔内注射戊巴比妥钠（50mg／kg）进行麻醉，记录 MAP。股动脉插管与压力换能器连接到聚乙烯导管，通过PowerLab数据采集系统，记录血压。

1.5 MPO活性测定将组织样品置于含有0.5%十六烷基三甲基溴化铵的50mmol／L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）中进行匀浆，然后在冰浴中超声处理10s，反复冻融3次后再进行超声处理后，4℃，12 000r／min，离心10min，分光光度法测定 MPO活性［5］。取0.1mL上清液，与2.9mL的50mmol／L磷酸盐缓冲溶液（含有20mmol／L的过氧化氢和20 g／L的盐酸盐）混合，用分光光度计测定在460nm处的吸光度值。1单位表示在25℃每分钟可降解1μmol过氧化物。

1.6 血浆白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平检测应用大鼠IL-6的内源性ELISA试剂盒（Endogen），根据说明书测定血浆中IL-6的水平［6］。

1.7 生存率分析 CS组、CS＋NaNO2-100组、CS＋NaNO2-200组、CS＋NaNO2-400组大鼠各25只，分别挤压6h后，观察其48h的生存率。

1.8 统计学方法应用SPSS13.1统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肌肉亚硝酸盐和横纹肌溶解标志物的含量变化与对照组相比，CS组损伤肌肉中亚硝酸盐含量显著下降，钾、CK和LDH含量显著增加（P＜0.05）。与CS组相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400组亚硝酸盐的含量显著升高（P＜0.05），其中CS＋NaNO2-400组升高最明显（P＜0.05）；CS＋NaNO2-100、-200、-400组血浆中钾、CK和LDH含量显著降低（P＜0.05），其中LDH含量随NaNO2浓度增加作用明显（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肌肉亚硝酸盐和血清横纹肌溶解标志物含量比较Table 1 Muscle nitrite levels and plasma rhabdomyolysis markers levels in I／R-injured CS rats（n=8,±s）

＊P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与CS组比较 △P＜0.05与CS＋NaNO2-100组比较 ☆P＜0.05与CS＋NaNO2-200组比较（q检验）

2.2 各组大鼠血压、pH值、HCO3-和碱剩余含量变化与对照组相比，CS组中MAP显著下降，血液中pH 值、HCO3-和碱剩余也显著减少（P＜0.05）；与 CS组相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400组MAP显著升高，血液中pH值、HCO3-和碱剩余显著增多（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠MAP、pH、HCO3-和碱剩余比较Table 2 MAP，pH，HCO3-and BE in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与CS组比较 △P＜0.05与CS＋NaNO2-100组比较 ☆P＜0.05与CS＋NaNO2-200组比较（q检验）

2.3 各组大鼠炎症相关因子的变化与对照组相比，CS组中血浆IL-6含量显著升高（P＜0.05）；与CS组相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400组血浆IL-6含量显著降低，但CS＋NaNO2-100、-200、-400组之间无明显变化（P＞0.05）。与对照组相比，CS组肌肉和肺中MPO的活性显著升高（P＜0.05）；与CS组相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400组肌肉和肺中MPO的活性显著降低，且CS＋NaNO2-400组作用明显（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血浆IL-6含量、肌肉和肺中MPO活性比较Table 3 IL-6level and MPO activity in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与CS组比较 △P＜0.05与CS＋NaNO2-100组比较 ☆P＜0.05与CS＋NaNO2-200组比较（q检验）

2.4 各组大鼠生存率比较 CS＋NaNO2-200组和CS＋NaNO2-400组的生存率高于CS组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠生存率比较Table 4 The survival rate of four groups（只数，%）

3 讨论

亚硝酸根是一氧化氮（nitric oxide，NO）氧化过程中的生理终产物。有研究表明，心肌中脱氧肌红蛋白主要在线粒体附近释放，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）导致I／R损伤［7-8］。Hendgen-Cotta等［9］报道，亚硝酸盐可以保护小鼠心脏发生心肌梗死，在肌红蛋白基因敲除小鼠中这种保护作用消失。因此，脱氧-肌红蛋白可能是I／R损伤肌肉细胞中亚硝酸盐生成NO的主要贡献者［10］。在缺血期间，因为肌肉中的亚硝酸盐含量降低，NO氧化酶（NO synthase，NOS）活性和亚硝酸盐消耗增加，肌肉中的基础亚硝酸盐基本用完，造成NO生物活性损失、再灌注血管内皮细胞和肌肉细胞的完整性损失。研究表明，亚硝酸盐的补充增加了心肌组织中NO的储备和生物利用度，防止I／R小鼠心脏损伤［4］。本研究结果表明，与对照组相比，CS组中亚硝酸盐的含量显著降低，而亚硝酸盐处理后肌肉中亚硝酸盐的含量显著提高，最终降低横纹肌溶解症，并且提高生存率。

再灌注后ROS诱导产生的自由基是I／R损伤的可能机制之一。在I／R损伤ROS产生的来源包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶、内皮型NOS和MPO［11］，而ROS主要来源于线粒体，线粒体电子传递链复合物的氧化还原状态快速变化，ROS形成大大提高，造成再灌注时大量的电子传递给氧。ROS诱导胞浆中酶发生变性，并且破坏细胞膜脂质过氧化过程。ROS介导的肌浆网功能障碍也导致大量细胞内钙超载，导致线粒体通透性转换孔开放，从而导致细胞坏死。亚硝酸盐对I／R损伤的细胞保护机制是由粒线体电子传递链复合物IS-亚硝基化介导的。S-亚硝基化的复合物I降低了线粒体ROS的形成，并且亚硝酸盐减少细胞色素C释放，抑制细胞凋亡［3］。本研究结果显示，亚硝酸盐治疗减少了血浆中横纹肌溶解标志物——钾、LDH和CK的释放。表明亚硝酸盐对CS受伤的肌肉细胞具有保护作用，具体的分子机制还需要进一步的研究。

本研究为了观察亚硝酸盐的抗炎作用，检测了受伤及周围组织中炎症因子IL-6的水平。IL-6升高的幅度与组织损伤严重程度和不良预后相关，因此，IL-6水平可用于评定患者的治疗效果［12］。IL-6水平增强反映了血管内皮细胞和循环中白细胞之间的异常相互作用，提示全身炎症反应，如多器官功能衰竭。本研究结果表明，亚硝酸盐处理后显著降低了血浆中IL-6水平和肌肉、肺中MPO的活性，从而减少了远程器官功能衰竭，并且提高了CS大鼠的生存率。

另外，要考虑的一个重要问题是亚硝酸盐治疗CS是否适用于临床上，取决于剂量、给药途径以及亚硝酸盐的不良反应——低血压。本研究结果表明，静脉注射200μmol／kg NaNO2后使 MAP增加，400μmol／kg NaNO2再灌注后6hMAP也维持在较高的水平，且400μmol／kg NaNO2与200 μmol／kg NaNO2处理的大鼠相比，生存率差异无统计学意义。亚硝酸盐的给药剂量和途径尚需进一步研究，亚硝酸盐治疗大鼠CS模型对生存率的有利影响，可能是通过恢复和改善周边微血管灌注和线粒体呼吸引起的。

综上所述，在CS大鼠模型中静脉给予亚硝酸盐可以明显降低I／R诱发肌肉损伤，并且可以提高生存率。

［1］ Guner SI，Oncu MR.Evaluation of crush syndrome patients with extremity injuries in the 2011Van Earthquake in Turkey［J］.J Clin Nurs，2014，23（1／2）：243-249.

［2］ Murata I，Ooi K，Sasaki H，et al.Characterization of systemic and histologic injury after crush syndrome and intervals of reperfusion in a small animal model［J］.J Trauma，2011，70（6）：1453-1463.

［3］ Nicholson CK，Lambert JP，Chow CW，et al.Chronic exercise downregulates myocardial myoglobin and attenuates nitrite reductase capacity during ischemia-reperfusion［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，64（11）：1-10.

［4］ Ingram TE，Fraser AG，Bleasdale RA，et al.Low-dose sodium nitrite attenuates myocardial ischemia and vascular ischemiareperfusion injury in human models［J］.J Am Coll Cardiol，2013，61（25）：2534-2541.

［5］ Pulli B，Ali M，Forghani R，et al.Measuring myeloperoxidase activity in biological samples［J］.PLoS One，2013，8（7）：e67976.

［6］高海燕，崔岭，韦洪艳，等.阿托伐他汀在冠心病治疗中IL-6、APN水平动态变化观察［J］.河北医科大学学报，2013，34（9）：1051-1053.

［7］ Shiva S，Huang Z，Grubina R，et al.Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration［J］.Circ Res，2007，100（5）：654-661.

［8］ Shiva S，Rassaf T，Patel RP，et al.The detection of the nitrite reductase and NO-generating properties of haemoglobin by mitochondrial inhibition［J］.Cardiovasc Res，2011，89（3）：566-573.

［9］ Hendgen-Cotta UB，Merx MW ，Shiva S，et al.Nitrite reductase activity of myoglobin regulates respiration and cellular viability inmyocardial ischemia／reperfusion injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（29）：10256-10261.

［10］ Hendgen-Cotta UB，Kelm M，Rassaf T.A highlight of myoglobin diversity：the nitrite reductase activity during myocardial ischemia／reperfusion［J］.Nitric Oxide，2010，22（2）：75-82.

［11］ Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39（1）：44-84.

［12］ Volpin G，Cohen M，Assaf M，et al.Cytokine levels （IL-4，IL-6，IL-8and TGF-β）as potential biomarkers of systemic inflammatory response in trauma patients［J］.Int Orthop，2014，38（6）：1303-1309.