丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠肾组织核转录因子κB表达的影响

熊园园,李中南，刘珊珊，张帆，张培培

(1.安徽中医药大学，合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院内分泌科；3.安徽省省直机关医院)



·基础研究·

丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠肾组织核转录因子κB表达的影响

熊园园1,李中南2，刘珊珊2，张帆2，张培培3

(1.安徽中医药大学，合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院内分泌科；3.安徽省省直机关医院)

[摘要]目的探讨核转录因子κB(NF-κB)在糖尿病大鼠肾组织中的表达水平及丹蛭降糖胶囊(DJC)的调节作用。方法取55只健康雄性大鼠按数字表法随机分为两组，即健康对照组和实验组。健康对照组予普通饲料喂养，实验组予高脂饲料喂养。采用链尿佐菌素(STZ)单次腹腔注射35mg/kg，建立糖尿病动物模型，造模成功后，再将实验组按数字表法随机分为丹蛭高剂量组,丹蛭低剂量组,吡咯列酮组和模型组。除模型组和对照组外，各组连续灌胃药物8周，丹蛭高、低剂量组分别按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮组按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康对照组和模型组按5 mL·kg-1·d-1给予0.9%氯化钠注射溶液灌胃。免疫组织化学法检测NF-κB在肾脏中的表达水平，并测定各组大鼠血糖。结果模型组的NF-κB的表达明显升高，与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；丹蛭高、低剂量组灌胃8周后，两组NF-κB的高表达明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。丹蛭降糖胶囊灌胃2周后，血糖显著下降，与模型组比较(P<0.01)，4~8周后血糖指标下降平稳(P<0.01)。结论丹蛭降糖胶囊可降低2型糖尿病大鼠血糖和抑制肾组织NF-κB的高表达。

[关键词]糖尿病肾病；NF-κB；降血糖药(中药);模型,动物

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见且最严重的慢性并发症之一，研究表明，炎症机制在糖尿病肾病的发生发展中发挥着重要的作用，有学者提出把糖尿病肾病看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病[1]。核转录因子κB(NF-κB)是一类重要的核转录因子，参与了炎症和凋亡等病理生理过程，与此同时NF-κB信号途径在胰岛素抵抗发生机制中有着非常重要作用，NF-κB信号转导通路的活化与炎性反应及胰岛素抵抗的发生密切相关[2-5]。本次实验旨在探讨丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠肾脏NF-κB表达的影响及其可能的调节机制。

1材料与方法

1.1实验动物 取健康雄性大鼠55只，体质量(190±20)g，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证：SCXK(皖)2012~2013。动物分笼喂养，自由饮食，室内通风良好，温度保持在18～25 ℃，相对湿度为40%～70%，适应性喂养1周。

1.2药物与试剂吡咯列酮(杭州中美华东制药有限公司产，15 mg/片,批号:Hz0050500)；丹蛭降糖胶囊(DJC)(0.4g/粒，由太子参、地黄、牡丹皮、泽泻、水蛭等组成，安徽中医药大学第一附属医院中药制剂中心生产，批号:20060601)；链尿佐菌素(STZ,美国Sigma公司，批号：S0130)；通用型二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：131208K)。

1.3主要仪器与设备血糖监测仪(美国强生公司产),JD801形态分析系统(购自江苏省捷达科技发展有限公司)。

1.4动物分组模型建立及干预55只健康雄性大鼠用基础饲料(蛋白质16%，碳水化合物50%，脂肪8%，购自安徽医科大学动物室)，适应性喂养1周，按数字表法随机抽取 9只作为健康对照组，余为实验组。健康对照组给予基础饲料喂养直至实验结束；实验组予以高脂饲料喂养(蛋白质14%，脂肪25%，碳水化合物51%，胆固醇5%，猪油10%)，4周后进行造模，禁食8 h 后，将STZ用0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%浓度，按35 mg/kg的剂量给大鼠左下腹单次注射，诱发糖尿病模型，120 h后取尾静脉测血糖，血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。剔除造模未成功的大鼠5只，将造模成功后的41只的大鼠按数字表法随机分成模型组11只，丹蛭低剂量组10 只，丹蛭高剂量组10只，吡格列酮组10 只，按人与大鼠单位体质量折算系数计算出药物组给药量，丹蛭高、低剂量组分别按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮组按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康对照组和模型组按5 mL·kg-1·d-1给予0.9%氯化钠注射溶液灌胃，继续给予高脂饲料喂养8周至实验结束，期间因血糖过高死亡2只，皮肤感染死亡2只。

1.5指标检测与方法连续治疗8周，禁食8 h，以3%水合氯醛按10 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速分离双肾，将新鲜组织置于冻存管中放于液氮中保存，严格按照免疫组织化学标准步骤进行操作。并于造模后、治疗后2周、4周和8周测定鼠尾随机末梢血糖。选用JD801形态分析系统，对所选取视野中免疫组织化学阳性信号进行图像分析，计算每个视野中NF-κB的阳性指数。免疫组织化学每张切片高倍镜下(×400)依次观察肾小球、肾间质区域不重叠视野，并分析NF-κB与血糖相关关系图。

1.6统计学处理使用SPSS17.0软件进行统计分析，两组比较采用t检验，组间比较采用方差分析。

2结果

2.1各组大鼠肾组织NF-κB表达的变化光镜观察显示：NF-κB在健康对照组肾组织中基本不表达或呈弱阳性表达；模型组的NF-κB在肾组织中表达明显升高，特别在肾小管及肾间质细胞中最为明显，呈强阳性；与模型组比较，丹蛭高、低剂量组肾组织NF-κB表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，吡格列酮组肾组织中NF-κB的表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)。丹蛭高、低剂量组中NF-κB阳性细胞数治疗后明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，疗效优于吡格列酮组，见图1，表1。

2.2对大鼠随机血糖的影响造模后，模型组，丹蛭高、低剂量组，吡格列酮组血糖较正常组明显升高(P<0.01)，治疗2周后，丹蛭高、低剂量组血糖明显降低(P<0.01)，丹蛭高剂量组疗效优于吡格列酮组。治疗4~8周后，血糖下降平稳，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3对NF-κB与血糖的相关性分析高血糖与NF-κB的表达呈正相关性，相关系数r=0.897,P<0.01。

3讨论

结合大量古今文献调查，在既往中医证候学调查的基础上，我们得出气虚阴亏血瘀为糖尿病肾病基本病机，并以此为理论依据，参照中医文献中药药理部分研究最新成果，选择具有益气养阴活血功效的丹蛭降糖胶囊，观察了对肾脏NF-κB的影响。本实验研究发现，与正常组比较，模型组大鼠肾组织中NF-κB活性明显升高。予丹蛭降糖胶囊灌胃8周后，肾组织中NF-κB表达明显减弱且优于吡格列酮组，提示丹蛭降糖胶囊可抑制糖尿病大鼠肾NF-κB的过高表达，从而发挥对肾脏的保护作用。本研究结果还显示丹蛭降糖方有很好的降糖效果(P<0.01)，其疗效与吡格列酮组近似。通过对糖尿病模型大鼠NF-κB与血糖相关性分析提示：NF-κB的表达与大鼠血糖呈正相关，表明NF-κB与血糖关系密切。目前，已证实高血糖和氧化应激的主要靶点是转录因子NF-κB，并通过其调控与炎症、细胞增殖、细胞分化等密切相关的多种基因的表达，更多的研究正逐步向人们揭示糖尿病与炎症和各种炎性因子之间存在必然的联系[6-7]。

本方由太子参、地黄、牡丹皮、泽泻、水蛭等组成，既符合气虚阴亏血瘀的中医病机，又符合糖尿病肾病现代药理研究基础[8]。方中水蛭是一味传统活血中药，对炎症的早期及后期病理改变均有抑制作用，对急慢性炎症有一定的控制作用，具有类炎性介质拮抗作用，可高效清除循环免疫复合物，调节机

表1　各组糖尿病模型大鼠NF-κB阳性面积、平均灰度、阳性指数的比较±s)

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

表2　对大鼠不同时间段血糖的影响±s)

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01体免疫功能[9]；太子参具有益气健脾、生津润肺作用，能改善糖尿病大鼠的一般状况，降低空腹血糖，降低三酰甘油和总胆固醇水平，但不影响胰岛素水平[10]；牡丹皮具有清热凉血，活血散瘀之功效，其主要活性成分为丹皮酚，蒋舜媛[11]的研究证明，牡丹皮具有解热、抗炎、保肝、抗变态反应的作用；生地黄可清热凉血，养阴生津，地黄苷D可明显提高血虚模型小鼠白细胞数、血小板数、网织红细胞数和骨髓 DNA 含量及重量，还有降低糖尿病模型小鼠血糖的趋势[12]。生地黄水煎剂对大鼠实验性甲醛足肿胀有显著的消肿作用[13]。

总之，本研究结果显示丹蛭降糖方可抑制糖尿病大鼠肾组织NF-κB表达，其机制可能是通过多途径干扰了炎症状态，对抗了炎性因子，抑制了NF-κB的高表达并降低血糖。

(本文图1见插图1-1)

参考文献

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[2]王水秀,马云青.NF-κB在2型糖尿病中的发病机制[J].赤峰学院学报,2012，28(1):49-51.

[3]夏丽娟,陈飞虎.核因子κB的分子生物学特性及其在炎症反应中的作用[J].安徽医药,2005,9(3):162-164.

[4]任莉荣,舒钧.核因子κB的研究进展[J].医学综述,2011，17(6):814-816.

[5]王景福,邢恩鸿,段书众，等.不同血糖控制水平糖尿病血液透析患者外周血单个核细胞核因子κB的活性[J].中国组织工程研究与临床康复,2011，15(53):10011-10015.

[6]耿明霞.各期糖尿病肾病患者血糖、血脂及胰岛素抵抗等指标的变化及相关性分析[J].微循环学杂志,2011,21(2):53-56.

[7]王扬天,王坚,马驰原.核因子κB与糖尿病的关系[J].医学研究生学报,2007，20(3):310-314.

[8]方朝晖,程森华,吴倩.丹蛭降糖胶囊对早期糖尿病肾病患者血NF-κB和尿白蛋白排泄率的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2013,15(5)：891-894.

[9]杨洪雁，杜智恒，白秀娟.水蛭药理作用的研究进展[J].东北农业大学学报,2012,4(3)：128-133.

[10] 王文凯,贾静,丁仁伟,等.太子参近年研究概况[J].中国实验方剂学杂志,2011，17(12):264-267.

[11] 蒋舜媛,李兴平,白莜璐,等.丹皮的抗内毒素和解热作用研究[J].中药药理与临床,2012，28(3):77-79.

[12] 刘朵,章丹丹,卞卡.地黄药理药化及配伍研究[J].时珍国医国药,2012，23(3)：748-750.

[13] 王裕生.中药药理与应用[M].北京:人民卫生出版社，1983：93-94.

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The influence of danzhijiangtang capsule on the expression of NF-κB in renal tissue of diabetic rats

XIONGYuanyuan*，LIZhongnan，LIUShanshan，ZHANGFan,ZHANGPeipei

(*AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression level of NF-κ B in renal tissue of diabetic rodent model and the regulating action of Danzhijiangtang Capsule(DJC) .MethodsFifty-five male SD rats were randomly divided into 2 groups:control group and experimental group.The control group was fed with basal diet,the experimental group were fed with high fat diet.The animal model of diabetes mellitus were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ,35mg/kg).The experimental group were randomly divided into 4 groups:high-dose DJC,low-dose DJC ,pioglitazone and model.The group of high-dose DJC and low-dose DJC were treated with 1.08 g·kg-1·d-1,0.54 g/(kgod),pioglitazone group was treated with 10 mg·kg-1·d-1,the blank group and the model group were treated with physiological saline 5 mL·kg-1·d-1,each group were kept intragastric administration for 8 weeks.The NF-κB was test by Immunohistochemical.ResultsThe expression of NF-κB in model group increased significantly compared with the normal control group (P<0.01);the expression of NF-κB in high DJC group and low DJC group were significantly decreased compared with model group after 8 weeks(P<0.01).After 2 weeks ,the level of glucose was decreased significantly compared with model group(P<0.01) ,the blood glucose declined steadily after 4-8 weeks(P<0.01).ConclusionDanzhiJiangtang Capsule can reduce the level of blood glucose in type 2 diabetic rats and inhibit the expression of NF-κB in renal tissues.

[Key words]Diabetic Nephropathies；NF-kappa B；Hypoglycemic agents(TCD);Models,animal

(收稿日期：2014-09-05)

Corresponding author:LI Zhongnan，Email:LZN5151307@sohu.com

中图分类号：R587.24

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.017

作者简介：熊园园，硕士在读，Email:2052910480@qq.com通信作者：李中南，主任医师，硕士生导师，Email：LZN5151307@sohu.com

基金项目：国家中医临床研究基地业务建设科研专项立项课题(JDZX2012004)